[发明专利]一种靶向昆虫Kir1通道的杀虫剂高通量筛选方法及应用

说明书

本发明公开褐飞虱与甜菜夜蛾内向整流钾通道Kir1的基因序列以及利用该通道建立的杀虫剂高通量筛选方法。本发明所述的内向整流钾通道基因Kir1是首次从半翅目昆虫与鳞翅目昆虫中克隆得到，Kir1通道与昆虫取食、排泄等生理过程的调控密切相关，抑制该通道会影响昆虫的取食与排泄过程，甚至引起昆虫死亡，因此该通道可作为新的杀虫剂靶标进行开发。将Kir1基因整合到表达载体中，通过转染使Kir1基因在细胞中表达，再连续筛选得到稳定表达Kir1的单克隆细胞株，该单克隆细胞株能稳定地表达具有内向整流特性的Kir1通道，再利用铊离子与钾离子在通过Kir1通道时的等效性，使用铊荧光试剂测定供试化合物对Kir1通道钾离子流的影响，从而从众多候选化合物中筛选出对Kir1通道具有抑制活性的潜在杀虫剂。

技术领域

本发明属于植物保护与生物技术领域，具体涉及昆虫内向整流钾通道以及以该通道作为杀虫剂靶标的筛选方法。

背景技术

农业害虫每年给农作物造成极其严重的经济损失，需要使用杀虫剂来控制其危害，以保障粮食与经济作物的安全。然而，杀虫剂的不合理使用使害虫种群逐渐产生适应性进化，田间出现抗药性种群，使杀虫剂的防治效果降低，甚至防治失败，这就需要不断地研发新型的药剂品种来取代已产生严重抗药性的品种。目前生产上使用的杀虫剂有许多类型，如有机磷酸酯类、氨基甲酸酯类、沙蚕毒素类、拟除虫菊酯类、新烟碱类、苯甲酰脲类以及双酰胺类等等，这些杀虫剂分别靶向不同的作用靶标，如乙酰胆碱酯酶、电压门控钠离子通道、乙酰胆碱受体、几丁质合成酶、鱼尼丁受体等。然而，针对这些作用靶标的杀虫剂，已有大量的害虫抗药性报道事例，人们希望挖掘全新的标靶蛋白作为杀虫剂的作用靶点。

研究表明，昆虫内向整流钾通道(Inwardly rectifying potassium channel，Kir)参与昆虫的取食、排泄等多个生理过程的调控，该通道的抑制会影响昆虫正常的生理过程，甚至造成死亡。Kir1通道抑制剂(VU041)能有效的抑制Kir1通道活性，并影响昆虫取食，具体表现为取食量明显减少、用于取食的时间显著地延长，说明内向整流钾通道Kir1参与了昆虫的取食行为调控。在对蚊虫研究中，Kir1通道抑制剂破坏蚊虫体内的钾离子平衡，从而干扰成蚊马氏管的正常分泌功能，使成蚊失去飞行能力，甚至造成成虫致死，这意味着昆虫内向整流钾通道可能作为杀虫剂的作用靶标进行开发。

传统的杀虫剂筛选通常采用昆虫活体生物测定的方法，但生物测定的方法效率很低，无法对大量化合物进行规模化的筛选。基于靶标蛋白的高通量筛选技术在人体药物的筛选中已有大量应用，但针对杀虫剂靶标的高通量筛选还很少。在众多的杀虫剂靶标蛋白中，仅针对乙酰胆碱酯酶的杀虫剂高通量筛选技术较成功，但针对乙酰胆碱酯酶的杀虫剂类型(有机磷与氨基甲酸酯类)已有60余年的应用历史，由于其活性以及安全性问题，目前关注这类杀虫剂的公司已很少。内向整流钾通道是非常有潜力的杀虫剂作用靶标，并且作用于该类钾通道药物的活性，可以采用稳定转染Kir通道的HEK293细胞和铊荧光试剂进行测定，据此可建立针对昆虫Kir1的杀虫剂高通量筛选模型。该高通量筛选技术的原理是利用Kir1通道对金属铊离子的通透性与钾离子相同，铊离子利用Kir1通道进入细胞，与胞内预先导入的荧光染料结合后会产生特定波长的荧光，胞内荧光强度越高说明进入胞内铊离子的量大，可间接地反映细胞膜上Kir1通道对钾离子的通透特性，从而用于定量分析药物对该通道是否有抑制或激活作用。

发明内容

本发明的目的在于提供褐飞虱与甜菜夜蛾2种昆虫的内向整流钾通道Kir1的核酸序列，以及靶向这些核酸序列编码蛋白的杀虫剂高通量筛选方法。

具体来说本发明通过以下技术方案达到发明目的，主要包括以下步骤：

一、克隆Kir1基因的开放阅读框序列