[发明专利]一种高灵敏的血清总胆汁酸电化学检测方法

说明书

本发明公开了一种高灵敏的血清总胆汁酸的电化学检测方法。本发明采用的电化学方法仅需直接稀释血清即可消除基质效应，采用高灵敏的双重氧化电化学法检测原理，具有操作简便和响应快速等特点，根据电化学响应信号与待测物浓度之间的线性关系，实现血清总胆汁酸的快速、准确定量。所述检测方法测定血清总胆汁酸的线性良好，灵敏度很高，可检测рmol级的血清总胆汁酸。所述方法检测血清总胆汁酸灵敏、快速，有望用于床旁检测，有较高的科研与临床应用价值。

技术领域

本发明属于电化学检测领域，主要涉及一种高灵敏的血清总胆汁酸电化学检测方法。

背景技术

胆汁酸是胆汁中存在的一大类胆烷酸的总称，是内源性胆固醇的主要代谢产物。生理条件下，胆汁酸随胆汁分泌到肠道，在回肠末端，约95％的胆汁酸经门静脉重吸收入肝，形成肠肝循环。胆汁酸在调节体内胆固醇代谢，促进脂类消化、吸收和防止胆道结石生成方面发挥重要作用。当肝细胞损伤或胆道阻塞会引起胆汁酸代谢异常，导致血中胆汁酸含量显著升高。因此，血清总胆汁酸被认为是肝实质性损伤的灵敏指标。血清总胆汁酸对妊娠期肝内胆汁淤积症和先天性胆道疾病等的诊断有很大的价值。另外，血清总胆汁酸水平可反映急慢性肝炎、肝纤维化和肝硬化门脉高压的病情演变，也是梗阻性黄疸患者梗阻解除的早期敏感指标。

目前，临床主要通过酶循环法测定血清总胆汁酸，其原理是胆汁酸在3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSD)和Thio-NAD⁺作用下生成3-酮类固醇及Thio-NADH。新生成的3-酮类固醇在3α-HSD及NADH的作用下生成胆汁酸及NAD⁺，这样血清中微量胆汁酸检测信号在多次酶循环过程中被放大，同时使生成的Thio-NADH扩增。Thio-NADH在405nm波长处有特异性吸收，通过测定Thio-NADH吸光度值的变化可求得血清中胆汁酸含量。该方法在临床应用较广泛，但其检测灵敏度在μmol/L，有待提高，且用于检测的专用仪器价格昂贵、体积较大无法移动。

电化学分析方法是根据物质在溶液中的电化学性质及其变化规律，以电位、电导和电流等电学量与被测物质量之间的计量关系，对组分进行定性和定量的仪器分析方法。应用电化学分析方法测定血清总胆汁酸具有如下优点：设备简单可移动性强，操作简便快速，灵敏度高，选择性好。目前，国内外还没有关于基于酶促偶联反应-双重氧化法，测定血清总胆汁酸的高灵敏电化学检测方法的相关研究报道。

发明内容

本发明致力于提供一种基于双重氧化的血清总胆汁酸的高灵敏电化学检测方法。本发明的电化学方法以直接稀释血清消除基质效应，省去复杂的样品预处理步骤，结合双重氧化电化学检测的灵敏、简便和快速等特点，通过电化学分析方法实现了血清总胆汁酸快速、准确的定量检测。

本发明的电化学检测方法的原理为：在丝网印刷碳电极(SPCE)的工作电极表面加入含有3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSD)、氧化型辅酶Ⅰ(NAD⁺)和三联吡啶钌(Ru(bpy)₃²⁺)的磷酸盐缓冲液，再施加一定的氧化恒电位，溶液中部分Ru(bpy)₃²⁺在电极表面被氧化为Ru(bpy)₃³⁺，形成Ru(bpy)₃²⁺/Ru(bpy)₃³⁺平衡状态，待基线稳定后加入待测血清，3α-HSD特异性催化胆汁酸生成3-酮类固醇和NADH，NADH在电极表面失去电子被氧化生成NAD⁺，同时Ru(bpy)₃³⁺还原成Ru(bpy)₃²⁺，Ru(bpy)₃²⁺在电极表面再次氧化为Ru(bpy)₃³⁺产生电化学信号，从而能在I-t曲线上对血清总胆汁酸进行间接电化学定量分析。