[发明专利]一种微球与抗体的定向偶联方法及应用

权利要求书

1.一种微球与抗体的定向偶联方法，其特征在于，羧基微球加入活化剂，35～38℃活化孵育0.5～1小时，除去活化剂，然后与抗体F(ab’)片段以巯基偶联的方式实现定向偶联，形成抗体微球复合物；所述的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺，且1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺的摩尔比是1:1～1:10。

2.根据权利要求1所述的定向偶联方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)全长抗体通过蛋白酶切反应制备得到抗体的F(ab’)₂片段，F(ab’)₂片段指包含抗体的F(ab)₂以及抗体全部铰链区的一种抗体片段；还原F(ab’)₂片段重链间的二硫键形成带有自由巯基的片段，即抗体F(ab’)片段；

2)羧基微球加入活化剂，35～38℃活化孵育0.5～1小时，除去活化剂，然后与抗体F(ab’)片段以巯基偶联的方式实现定向偶联，形成抗体微球复合物。

3.根据权利要求2所述的定向偶联方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)抗体F(ab’)₂片段的制备：向抗体中加入蛋白酶进行酶切反应，4～40℃反应0.5～4小时后终止反应，得到F(ab’)₂片段；

(2)抗体F(ab’)₂片段的还原：向步骤(1)得到的F(ab’)₂片段中加入还原剂，4～40℃条件下反应0.5～2小时，纯化得到含有自由巯基的F(ab’)片段；

(3)F(ab’)片段与微球偶联：羧基微球加入活化剂，35～38℃活化孵育0.5～1小时，除去活化剂，加入步骤(2)得到的含有自由巯基的F(ab’)片段，使之以巯基偶联的方式定向偶联到微球上。

4.根据权利要求3所述的定向偶联方法，其特征在于，步骤(1)所述的蛋白酶为胃蛋白酶；蛋白酶的浓度为30～200U/mg抗体。

5.根据权利要求4所述的定向偶联方法，其特征在于，步骤(1)所述的蛋白酶的浓度为50～100U/mg抗体。

6.根据权利要求5所述的定向偶联方法，其特征在于，步骤(1)所述的蛋白酶的浓度为60U/mg抗体。

7.根据权利要求3所述的定向偶联方法，其特征在于，步骤(2)所述的还原剂包括但不限于TCEP、DTT、β-巯基乙醇、β-巯基乙胺中的一种或多种；所述还原剂的浓度在0.2～50mM。

8.根据权利要求7所述的定向偶联方法，其特征在于，步骤(2)所述的还原剂为β-巯基乙胺；所述还原剂的浓度在0.2～10mM。

9.根据权利要求8所述的定向偶联方法，其特征在于，所述还原剂的浓度为2mM。

10.根据权利要求1所述的定向偶联方法，其特征在于，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与羧基微球的摩尔比为0.2:1～10:1。

11.权利要求1所述的定向偶联方法形成的抗体微球复合物。

12.一种组合物，包含权利要求11所述抗体微球复合物和药学上的常用辅料。

13.权利要求1～6任一项所述的方法、权利要求11所述的抗体微球复合物或权利要求12所述的组合物在制备免疫诊断或检测试剂中的应用。

14.权利要求1～6任一项所述的方法、权利要求11所述的抗体微球复合物或权利要求12所述的组合物在制备治疗疾病药物中的应用。