[发明专利]一种微球与抗体的定向偶联方法及应用

说明书

本发明公开了一种微球与抗体的定向偶联方法，羧基微球与抗体F(ab’)片段以巯基偶联的方式实现定向偶联，形成抗体微球复合物。该方法能够有效控制抗体与微球连接时的方向，实现定向偶联从而提高胶乳增强免疫比浊试剂的灵敏度，并能提高试剂对于类风湿因子(RF)的抗干扰能力。

技术领域

本发明涉及医学检测领域，尤其涉及一种通过定向偶联提高胶乳试剂灵敏度和特异性的方法和应用。

背景技术

胶乳增强免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)是一种稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法分为两种，一种是散射比浊检测法；另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理都是在高分子胶乳微球的表面交联多克隆抗体或者单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变反应液的散光性能或透光性能。反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是基于这一原理在均相反应体系中进行抗原抗体免疫反应从而测定待检测体液蛋白的含量。此外，该方法使用全自动生化分析仪进行检测，自动化程度高，排除了环境等因素的干扰，使得该方法相比于酶联免疫吸附法、免疫层析法等方法学具有更好的测试稳定性、准确性，检测通量高。

目前，PETIA检测试剂所采用的微球粒径分布从20nm～4μm，在微球与抗体之间增加的桥联化学臂一定程度上降低了抗体与微球结合时的位阻效应，一方面提高了抗体的有效偶联量，另一方面有效的保护了抗体的三维结构，有效保护了抗体的生物活性区域。检测试剂的灵敏度因此得到了极大的改善，可以达到1.0ng/ml。虽然比ELISA等方法学的灵敏度要差一些，但是对于现有的许多体液蛋白在正常人体内的含量，已基本可以满足临床检测要求。

然而随着检验医学的飞速发展，对于低浓度检测物质的检测越来越多，其检测浓度已从μg/ml级别下降至ng/ml级别，甚至是更微量的pg/ml级别，这对于体外诊断试剂的灵敏度要求也越来越高。目前常用于提高胶乳增强免疫比浊试剂测试灵敏度的方法，包括使用更高亲和力的抗体，使用粒径更大且稳定性更好的微球等，但是对于这些方法的实现，开发难度大，且会在现有基础上大幅度提高试剂的研发及生产成本，无法在胶乳免疫比浊试剂开发上实现普及应用。

在胶乳增强免疫比浊试剂制备过程中，抗体与微球的偶联方法众多，但是都存在一个问题，即抗体在连接到微球上的方向无法控制。众所周知，抗体与抗原结合的区域位于抗体的F(ab)片段上，若在偶联过程中，与微球相连的是抗体的F(ab)片段，那么向外伸展的就是与抗原没有结合活性的Fc片段，这就导致这一偶联抗体为无效抗体。而在抗体与微球进行偶联过程中，抗体的连接方向存在很大的随机性，无效连接抗体的存在使得抗体的利用率不高，并大大降低试剂最终的灵敏度。已经提出的方法有CN106501505A中提及的定向偶联方法，但该方法仍有两个缺点。一是本实验室研究结果及梁延桂在其硕士学位论文中的研究结果表明，全长抗体还原后目的产物的得率很低。还原全长抗体的目的是打开位于Fc段的重链间的两对二硫键，获得一条重链和一条轻链通过二硫键连接的抗体片段，并利用形成的自由巯基进行定向偶联。但通过使用不同种类的还原剂、不同的还原时间以及不同的还原条件进行抗体还原方案的筛选，最终目的产物得率均不超过25％。二是该方法易造成类风湿因子(RF)的干扰，降低试剂的灵敏度和特异性。

发明内容

本发明的目的是提供一种微球与抗体的定向偶联方法，该方法能够有效控制抗体与微球连接时的方向，实现定向偶联从而提高胶乳增强免疫比浊试剂的灵敏度与稳定性，并同时提高试剂对于类风湿因子(RF)的抗干扰能力及实现试剂对全血样本的检测。本发明的另一目的是提供该方法在PETIA方法学制备的体外诊断试剂盒中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

本发明提供一种微球与抗体的定向偶联方法，羧基微球与抗体F(ab’)片段以巯基偶联的方式实现定向偶联，形成抗体微球复合物。