[发明专利]一种脂肪间充质干细胞分离培养及制剂制备方法

权利要求书

1.一种脂肪间充质干细胞分离培养及制剂制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)血小板分离和富血小板因子血浆制备；

2)脂肪间充质干细胞的分离、培养；

3)脂肪间充质干细胞制剂制备；

4)干细胞因子制备。

2.根据权利要求1所述的血小板分离和富血小板因子血浆制备，其特征在于，用密度梯度离心法和差速离心法获得血小板，用自体血浆重悬血小板后，经过3次反复冻融，2000g离心，上清液过滤至洁净容器中。

3.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞和细胞外基质的分离，其特征在于，对洗涤后的脂肪依次通过1.2mm、1.0mm、0.8mm、0.6mm孔径的纳米脂肪乳化器反复推注20次、0.1-0.2mm筛网过滤、300g离心细胞沉淀用含富血小板因子血浆的培养基重悬、接种培养，上清收集置于冷冻冰箱保存，制剂时解冻后转移每10ml至50ml密封注射器中，反复抽拉注射器栓的同时震荡摇晃，待细胞外基质从油脂析出，将混合物置于50ml离心管，3000g离心弃上清取细胞外基质沉淀。

4.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞制剂的制备，其特征在于，待脂肪间充质干细胞生长融合至80％，用重组胰蛋白酶消化，待细胞缩小用胰酶抑制剂终止消化，离心洗涤两遍，将收获的脂肪间充质干细胞与细胞外基质沉淀混合。

5.根据权利要求1所述的干细胞因子的制备，其特征在于，收集培养干细胞的上清夜，经过离心、过滤获得干细胞因子。

6.根据权利要求2所述的密度梯度离心法，其特征在于，分离液密度为1.037-1.077，优选的分离液密度为1.057，其原料包括但不限于聚蔗糖-泛影葡胺和聚乙烯吡咯烷酮硅胶。

7.根据权利要求2所述的密度梯度离心法和差速离心法，其特征在于，离心条件为400-800g/15-30分钟/慢升慢降，优选的离心条件为500g/20分钟/慢升慢降，吸取中上层血小板后加入生理盐水，400g/8分钟离心取上层液体，1600g/5分钟离心弃上清。

8.根据权利要求2所述的冻融，其特征在于，置于液氮中30秒后迅速于37℃水浴锅解冻。

9.根据权利要求3所述的含富血小板因子血浆的培养基，其特征在于，富血小板因子血浆的浓度为1％-5％，优选的浓度为2.5％，培养基包括但不限于MEM、DMEM的基础培养基及各种干细胞无血清培养基。

10.根据权利要求6所述的干细胞因子，其特征在于，不含动物源性成分，为自体血小板因子和自体脂肪干细胞因子的混合物，可直接应用，也可经过超滤工序后，与维生素C、维生素E、玻尿酸等联合应用。