[发明专利]一种恩拉霉素高产菌株选育方法

权利要求书

1.一种恩拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：步骤如下：

一、确定产恩拉霉素菌株的短板基因；

二、构建硫链丝菌素抗性基因整合型载体；

三、将步骤二的整合型载体接合转移到链霉菌；

四、筛选步骤三中具有硫链丝菌素抗性基因标记成功的菌株SKD；

五、检测菌株SKD对硫链丝菌素最低抑菌量；

六、对标记成功的菌株SKD进行紫外诱变获得诱变菌株；

七、筛选诱变菌株中经过诱变后提高硫链丝菌素抗性的菌株；

八、将步骤七中抗性高的菌株中的tsr标记基因的敲除，将步骤一种的短板基因endX插入到敲除位置，进行菌株的回复突变，获得回复突变菌株；

九、将步骤八中回复突变成功的菌株进行测活，获得恩拉霉素高产菌株。

2.根据权利要求1所述的恩拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：所述步骤一中通过转录组测序分析得到恩拉霉素生物合成过程中基因簇的限速酶编码基因为短板基。

3.根据权利要求1所述的恩拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：步骤二的过程如下：

(1)利用NCBI数据库查的找杀真菌链霉菌恩拉霉素合成基因簇，根据序列找到endD基因序列，设计敲除该基因的两段同源臂，以合成的tsr基因为模板，克隆不带有启动子的tsr片段，设计引物命名为DL-F、DL-R、DR-F、DR-R、tsr-F、tsr-R；(2)通过PCR方法克隆出同源臂及不带有启动子的tsr片段；(3)将3个片段分别连接到PMD19-T，将3个连接体系化转到大肠感受态JM109中，其中大肠使用的培养基为LB，提质粒后酶切验证，将正确的质粒分别命名为T-DL、T-DR、T-tsr；(4)酶切T-DL、T-DR、T-tsr3个质粒和pKC1139，回收3个目的片段，及被切开的载体pKC1139，将3个目的片段及载体连接，将连接体系化转到大肠感受态JM109中，提质粒酶切验证，将正确的质粒命名为pKC1139D；(5)将质粒pKC1139D化转到E.coliET12567感受态细胞中，菌落PCR验证后，挑取正确的大肠杆菌转化子与杀真菌链霉菌做接合转移，通过接合转移的方法将质粒转移到杀真菌素链霉菌中。

4.根据权利要求1所述的恩拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：步骤六的过程如下：

将菌株SKD于MS斜面培养基中划线，于28℃恒温培养箱中培养7天。将培养好的新鲜孢子斜面中加入10mL灭菌的生理盐水，用接种环将孢子刮下，并将其转移至含玻璃珠的灭菌大试管中，利用涡旋震荡打散孢子，再经脱脂棉过滤获得单孢子悬液；

将获得的单孢子悬液用无菌生理盐水进行离心洗涤，反复3次。向沉淀孢子中加入无菌生理盐水进行稀释，控制稀释倍数后，进行血球板显微计数，调整单孢子悬液中的孢子浓度为10⁸个/mL；

取6mL稀释后的单孢子悬液，置于直径为7cm的平皿中，开盖，放入转子搅拌器；将紫外灯预热30min，其中紫外灯的功率设定为15W，照射波长为254nm，照射距离为30cm。将平皿避光放置于磁力搅拌器上，边搅拌边照射，紫外灯照射时间分别设定为90s；

对短板菌株的孢子悬液进行紫外诱变处理，将诱变后的孢子离心沉淀后，全部转接至2XYT液体培养基中，在避光条件下，28℃、220r/min摇床培养一天，使突变后菌株的表型得以充分表达；

使用生理盐水洗涤，将培养物分别涂布于MS培养基上，于28℃下恒温培养6-8天，挑取单个菌株培养于MS培养基上6天。

5.根据权利要求1所述的恩拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：步骤七的过程如下：

将突变菌株进行发酵，用发酵液涂板筛选更高抗性的突变株，用浓度为1.75mg/mL和2.0mg/mL的板进行筛选，得到硫链丝菌素抗性得到提高的菌株。