[发明专利]一种恩拉霉素高产菌株选育方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种获得高产恩拉霉素菌株的选育方法，属于一种利用链霉菌提高抗生素产量的技术领域，具体涉及高产菌株的选育、中间载体的构建、利用抗性筛选及回补基因获得高产菌株。

背景技术

恩拉霉素(Enramycin)又名持久霉素，是由土壤中的放线菌发酵产生的一种非核糖体多肽(NRP)类抗生素，对革兰氏阳性菌特别是禽畜肠道内有害梭状芽孢杆菌具有较强的抑制作用；饲料中添加适量的恩拉霉素不仅可以预防常见的动物消化道疾病，还可改善动物肠道内的群落平衡，有利于饲料营养成份的消化吸收，促进动物增重。同时恩拉霉素具有广谱、低毒、无残留、不易产生耐药性和交叉抗性等优点，因此是目前少数几种可用于饲料添加剂的抗生素之一。目前恩拉霉素的生产主要由抗真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)发酵获得，由于该菌株在发酵过程中普遍存在发酵周期长、产素水平低、菌株退化严重等问题，限制了恩拉霉素的大规模生产和进一步的推广应用。因此采用遗传育种技术进一步提高恩拉霉素产生菌的产素水平及生产性能，对于降低恩拉霉素生产成本、提高市场竞争力具有重要的意义。

目前针对放线菌的遗传育种方法主要有两种：一种为传统(物理/化学)诱变育种技术，即利用紫外诱变、化学诱变、微波诱变、太空诱变以及离子束诱变等技术对生产菌株进行诱变处理，然后通过大量筛选，获得生产性能更为优良的变异菌株。该方法在抗生素高产菌株的选育方面贡献巨大，目前已成功选育出很多优良菌种。王世梅等利用紫外线诱变选育出数株阿扎霉素(Azinomycin)B产量较出发菌株高3倍以上的高产菌株，且传代稳定；阎永贞等对一株纳他霉素产生菌Streptomyces natalensis SIPI-NHF09进行了紫外和微波相结合的诱变处理，并获得了一株纳他霉素高产突变株，其纳他霉素产量是出发菌株的3.5倍，且遗传性状稳定，具有一定的产业化开发价值。但是传统的诱变育种技术也存在很大缺陷，优良突变菌株的筛选往往具有很大的盲目性，筛选工作量非常大。特别是对放线菌等生长周期较长的菌种而言，筛选工作更是费时费力，短时间内往往难以达到理想效果。另外一种针对放线菌的遗传育种方法为：现代分子生物学遗传育种技术，即通过对特定基因进行遗传改造来进一步提高菌株的生产性能。该方法可直接针对影响菌株产素水平的基因进行遗传改造，目的性更强，遗传操作也很简便。然而对于大部分抗生素产生菌而言，由于其抗生素的生物合成机制及代谢调控机制非常复杂，抗生素的产生往往受多重因素调控，因此很难通过简单的遗传操作而达到理想效果。

基于上述两种遗传育种方法中存在的优势和不足，我们对上述两种方法进行了优势组合，并针对恩拉霉素产生菌，发明了一种新的菌种选育方法。即首先通过定向遗传改造技术，将一个抗生素抗性标记基因(tsr ORF)整合至菌株基因组中的特定位点，使其与菌株中某些关键基因的表达相关联，进而与菌株中的恩拉霉素产生水平相关联；然后对改造后的菌株进行诱变处理(化学或物理诱变)，并从中筛选出硫链丝菌素高抗性突变株，这些菌株一般具备较大的产素潜力；最后通过回补反应，去除tsr标记基因，恢复原有基因结构，从而获得抗生素高产菌株。该方法为恩拉霉素高产菌株的选育提供了一个筛选标记，可大大提高恩拉霉素高产菌株的筛选效率。

发明内容

本发明提出了一种抗生素高产菌株筛选的方法，该方法涉及到寻找恩拉霉素合成基因簇中(短板基因)endX基因，结合物理诱变及分子生物学，通过添加筛选标记，再通过紫外诱变方法，提高硫链丝菌素抗性表达量，通过高抗性筛选，同时筛选出(短板基因)endX高表达量的菌株，通过回补实验，将基因恢复完整后，得到高产菌株，以实现恩拉霉素高产菌株的快速高效筛选。本发明提供的提高恩拉霉素产量方法的流程图如图1所示。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种恩拉霉素高产菌株选育方法，步骤如下：

一、确定产恩拉霉素菌株的短板基因；

二、构建硫链丝菌素抗性基因整合型载体；

三、将步骤二的整合型载体接合转移到链霉菌；

四、筛选步骤三中具有硫链丝菌素抗性基因标记成功的菌株SKD；

五、检测菌株SKD对硫链丝菌素最低抑菌量；

六、对标记成功的菌株SKD进行紫外诱变获得诱变菌株；

七、筛选诱变菌株中经过诱变后提高硫链丝菌素抗性的菌株；

八、将步骤七中抗性高的菌株中的tsr标记基因的敲除，将步骤一种的短板基因endX插入到敲除位置，进行菌株的回复突变，获得回复突变菌株；

九、将步骤八中回复突变成功的菌株进行测活，获得恩拉霉素高产菌株。