[发明专利]一种纳米颗粒耦合探针体系在ctDNA高灵敏检测中的应用

说明书

本发明涉及一种纳米颗粒耦合探针体系在ctDNA高灵敏检测中的应用，纳米颗粒耦合探针材料体系由第一探针和第二探针组成，第一探针的表达式为MNP@X‑DNA₁，其中MNP为磁性纳米颗粒内核，X为包覆在磁性纳米颗粒内核的亲水性壳层，DNA₁为修饰在亲水性壳层上的能够与目标循环肿瘤DNA的第一部分互补的第一互补核酸链，第二探针的表达式为Rep‑DNA₂，其中Rep为能用ICP‑MS检测的报告元素形成的报告元素内核，DNA₂为修饰在报告元素内核上的能够与目标循环肿瘤DNA的第二部分互补的第二互补核酸链。本发明的双纳米探针MNP@X‑DNA₁与Rep‑DNA₂的制备简单、可控、易重复。

技术领域

本发明属于医用生物纳米材料技术领域，具体涉及一种ctDNA检测用纳米颗粒耦合探针材料及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤产生的第一步是基因突变，癌症归根结底是一种基因病。随着癌症研究的不断深入，人们在癌症患者的外周血中检测到与肿瘤细胞一致的突变基因，即循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)。ctDNA是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的基因碎片，是癌症散落在血液中的“信息密码”。癌症的分期直接与血液中的ctDNA浓度相关，中晚期患者ctDNA浓度显著高于早期或者超早期患者。ctDNA浓度随肿瘤发生发展而升高，因肿瘤得到控制而降低，是一类高敏感性、高特异性的肿瘤血液标记物。ctDNA浓度的变化要远早于影像学等手段检测到肿瘤组织的变化。与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比，对ctDNA的精准分析能实时监测病人体内肿瘤负荷的动态信息，可更加敏感地发现疾病的变化，更加科学、迅速的评价某一治疗方案的效果，优势显著。最为重要的是，对ctDNA的监测只需要抽取患者少量外周血，对患者没有副作用，可实现多次实时高频监测。因此，ctDNA的检测及其生物学指标的研究将有可能为临床肿瘤的早期诊断、预后判断及跟踪随访提供一系列方便、快捷、特异、无创的检测手段。ctDNA检测是一种新型无创的“液体活检”方式，有望弥补现有临床诊断方法的不足，提供从肿瘤细胞水平到分子水平的分析平台，为个体化治疗提供参考。基于ctDNA检测的无创的“液体活检”技术有望取代侵入性的“组织活检”用于肿瘤治疗进展的监测，该领域的基础研究具有非常重要的科学意义和临床价值。

ctDNA检测是肿瘤早期筛查的绝佳方式，但是在肿瘤发生的早期、超早期甚至细胞阶段，血液中的ctDNA浓度极低(10～180ng.ml^-1)，如何检测出早期癌症患者血液中极低含量的ctDNA是首要技术难点。这对检测方法的灵敏度提出了很高的要求。另外，病人的血清成分异常复杂，ctDNA只占血液系统中总核酸中的0.01％-1％，因此要实现ctDNA的高灵敏度检测，另一技术难点就是如何避免严重的背景基因干扰。近年来，越来越多的学者致力于ctDNA检测的研究。已经报道的检测方法主要是基于两个思路，一是通过聚合酶链式反应(PCR)大幅度扩增ctDNA，使之达到可以检出的浓度。包括数字PCR和BEAMing技术。数字PCR可用于评估和检测血浆中的ctDNA的特异性突变，可用于绝对定量，灵敏度可达单个核酸分子，检测限低至0.001％。BEAMing技术结合数字PCR与流式技术来确定突变情况，灵敏度达到0.005％。另一个现有的检测思路是直接进行全基因组测序或者PCR扩增后再进行测序，包括标记扩增深度测序(TAM-Seq),癌症个体化深度测序(CAPP-Seq),全基因组测序，全外显子测序等。TAM-Seq是先利用特异性引物进行循环的目标区域扩增，再利用不同特性的接头标签进行二次扩增，然后进行双向重复测序。CAPP-Seq利用定制化的突变位点库作为“筛选器”，对样本进行靶向捕获后再进行超深度测序，检测灵敏度高，特异性强。