[发明专利]一种高效检测甜味强度的工程化酵母生物系统及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，可应用在各类食品、医药、饮料、添加剂等行业，可对各种不同甜味物质的甜味强度进行检测。

背景技术

甜味是最受人类欢迎的味感，它能够用于改进食品的可口性和某些食用性质，同时给人带来愉悦的感受，所以甜味剂被广泛应用于食品、饮料、医药、添加剂等行业。随着生活水平的提高，人类对于甜食的依赖程度也越来越高，而过多的食用甜食可能会导致肥胖等问题，世界卫生组织通过调查分析指出，长期食用糖可使人的寿命缩短大约20年。所以积极研究寻找口感好、对人体无害、低热量的甜味剂这项工作与人类生活息息相关，对提高人类生活水平意义重大。甜味的强弱可以用甜味强度来表示，它是甜味剂的重要指标，目前的对于甜味强度的检测方法，主要有感官分析、电子舌检测分析、细胞株法。其中，感官分析法以人作为感官评价的主体，具有不稳定性和易受干扰等特点；电子舌检测法设备成本较高，且传感器具有选择性和限制性，对样品定量分析还不够成熟，不同样品需进行不同的摸索，难以普及；细胞株法由于细胞培养条件苛刻、周期过长，增加了资金、时间等成本，很难应用于实际生产当中。

发明内容

为了克服现有甜味物质的甜味强度检测方法的中成本较高、稳定性差、易受干扰、普适性不够等缺点，发掘更多未知甜味物质，并制定新的甜度标准，本发明使用遗传背景清晰、绝对生物安全并且生长周期短的酿酒酵母为宿主，表达G蛋白偶联甜味受体T1R2/T1R3，分别将不同甜味物质加入到培养环境中，甜味物质分子与甜味受体结合后，利用宿主自身G蛋白信号通路将信号放大，激活下游检测线路，表达荧光蛋白或酶，通过比荧光强度或相应的酶催化情况来表征甜味物质的甜味强度。由于培养条件简单、成本低廉、周期短、检测范围广、可重复性高、稳定性高等优势，可实现对不同甜味物质甜味强度的高效检测。

本发明专利解决技术问题所采取的技术方案是：一种融合了T1R2/T1R3甜味受体和检测基因线路，以酵母细胞为宿主的生物系统，包括进行过密码子优化的甜味受体蛋白T1R2/T1R3，改造后适用于甜味受体蛋白T1R2/T1R3的G蛋白α亚基Gpa1蛋白，以及排除了信号干扰、增强甜味强度信号的G蛋白偶联信号通路，诱导型、具有荧光蛋白或酶作为报告基因的检测基因线路。

上述生物系统，所述T1R2/T1R3甜味蛋白受体，通过PDB数据库获取基因序列，并进行适用于酵母细胞的密码子优化，再通过已知数据和实验验证对Gpa1的基因序列进行优化，将 Gpa1、T1R2/T1R3蛋白的基因序列进行合成，再将其导入宿主细胞中，对修饰后的Gpa1蛋白与甜味受体蛋白T1R2/T1R3进行表达，解决异源信号通路不兼容问题。

上述改造菌株，所述G蛋白偶联信号通路，将酿酒酵母基因组中与G蛋白信号通路有关的3个基因far1,ste2,sst2进行基因敲除。其中敲除ste2基因排除信息素对于信号通路的干扰，敲除sst2基因增强gpa1基因的信号传导，敲除far1基因避免改造后酵母甜味信号对于酵母正常生理功能的干扰，解决了稳定性差、易受干扰等问题。

上述改造菌株，所述检测基因线路为包括特异性激活的诱导型启动子P_fus、荧光蛋白或酶基因、终止子cyc1t的表达盒。

本发明达到的效果是，通过酵母细胞异源表达甜味受体T1R2/T1R3，偶联下游信号通路，对现今市场上已有的大部分甜味剂进行验证、修改，建立新的甜度标准，并检测新的甜味物质。由于本发明使用的宿主稳定，生长周期短，培养条件温和，培养成本低，甜味受体对于甜味物质具有普适性，实现了对甜味物质快速高效的检测标定。

附图说明

图1为甜味信号接受、传导、放大、输出示意图。

图2为在宿主培养环境中加入不同浓度α信息素时，宿主的生长曲线。

图3为△sst2菌株加入不同浓度α信息素之后的生长曲线。

图4为△far1+△sst2菌株加入不同浓度α信息素之后的生长曲线。

图5为导入检测基因线路之后，酵母细胞在加入不同浓度α信息素情况下的荧光表达曲线。

图6为导入检测基因线路的△far1+△sst2酵母细胞在加入不同浓度α信息素情况下的荧光表达曲线。

图7为导入检测基因线路的△far1+△sst2+△ste2酵母细胞在加入不同浓度α信息素情况下的荧光表达曲线。

图8为导入检测基因线路、T1R2/T1R3甜味受体的△far1+△sst2+△ste2酵母细胞的免疫荧光图，左图为明场条件下，右图为荧光激发条件下。

具体实施方式

下面通过实施例进一步阐明本发明，但不限于此。