[发明专利]一种鼻咽癌发病风险关联检测的分子方法

权利要求书

1.一种鼻咽癌发病风险关联检测的分子方法，其特征在于，所述鼻咽癌发病风险关联检测的分子方法包括以下步骤：

步骤一，血液基因组DNA的提取；

步骤二，PCR技术；

步骤三，限制性片段长度多态性酶切分析。

2.如权利要求1所述的鼻咽癌发病风险关联检测的分子方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：

(1)室温解冻冻在-80℃抗凝管的全血，取200μl的血液于1.5ml的离心管中；

(2)加入20μl的蛋白酶K，混匀；

(3)加入200μl的缓冲液GB，颠倒混匀，水浴箱70℃放置10min，溶液变清凉，短暂离心，除去离心管盖和内壁上的水珠；

(4)加入200μl无水乙醇，振荡摇匀15s，短暂离心，以除去离心管盖和内壁上的水珠；

(5)所得的溶液转移到吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

(6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(9)重复(8)；

(10)离心2min，弃废液，把吸附柱CB3放回收集管中，室温放置5分钟，晾干吸附材料上残余的漂洗液；

(11)把吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附柱膜的中间部分悬空滴加50μl的超纯水，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；

(12)将离心管中收集的溶液再加入吸附膜中间部分，室温放置2min，12000rpm离心2min，将所得溶液收集到离心管中，测得浓度，并保存于-20℃。

3.如权利要求2所述的鼻咽癌发病风险关联检测的分子方法，其特征在于，所述步骤二PCR技术具体包括：

①PCR管内加入下列物质，总体积：15μl

②将混合短暂离心，放入PCR仪，反应条件：

③将PCR产物放入-20℃保存。

4.如权利要求1所述的鼻咽癌发病风险关联检测的分子方法，其特征在于，所述步骤三限制性片段长度酶切多肽性分析

①PCR管中加入下列物质，总体积10μl

②将试剂混匀后，短暂离心，置37℃水浴3h后，-20℃保存。

5.如权利要求3所述的鼻咽癌发病风险关联检测的分子方法，其特征在于，所述水平式琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物具体操作包括：

①选择配套的25孔点样梳子，对准电泳槽插梳子位置，垂直架在电泳胶模的一端，使梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm；

②100ml的1xTBE缓冲液，制备成3％琼脂糖凝胶，加入5μl溴化乙锭，摇匀，将15ml酶切产物与溴酚蓝指示剂缓冲液混合，短暂离心，用微量移液器将样品小心加入加样孔内电泳；150V恒压，25min

③电泳完毕后，关闭电源，取出凝胶，在254nm波长的紫外透射显影仪下观察，读取并记录条带位置。

6.如权利要求1所述的鼻咽癌发病风险关联检测的分子方法，其特征在于，所述步骤四之后用平均值±标准差表示；Pin1两多态性位点基因型的分布和等位基因的频率在鼻咽癌病人组和正常人对照组中的比较采用卡方检验；两多态性位点与鼻咽癌发病风险的相关性采用的是多元回归分析，用OR值和95％CI值表示；两位点与鼻咽癌临床因素关系分析采用卡方检验和Fisher’s确切概率法；采用连锁不平衡检测两位点，并用在线的SHEsis单体型分析两位点单倍体与鼻咽癌发病风险的关系。