[发明专利]一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于保健食品活性成分检测领域，涉及蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉活性成分的检测，特别涉及一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法。

背景技术

冬虫夏草为麦角菌科的药用真菌，含有丰富的生理活性物质，具有独特的药用价值和广泛的药理作用，是中国特产的名贵中药材。近年来，人们从冬虫夏草真菌菌丝中分离出多种生物活性物质，主要有腺苷、虫草多糖、D-甘露醇、甾醇类等成分，这些主要成分具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等多种生理功能。

目前，冬虫夏草的人工培育技术已较为成熟，根据培养方式的不同可分为固体栽培和液体发酵两种。与固体栽培相比，液体发酵具有周期短、工艺简单、不易污染、菌丝体产量大等优点。中国科学院微生物研究所和南开大学权威部门通过对天然冬虫夏草液体发酵方法培养得到蝙蝠蛾拟青霉蝙蝠蛾拟青霉菌丝体。研究显示蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中的腺苷等有效成分的含量与野生冬虫夏草相当，具有广阔的应用前景。

腺苷又称腺嘌呤核苷，是人体循环疾病的药物。因为腺苷具有舒张血管、降低血压、减慢心率、抑制血小板等多种生理活性。腺苷是合成三磷酸腺苷(ATP)的主要原料，ATP已广泛应用于治疗心脑不全、脑动脉硬化及肌肉萎缩等症。腺苷已成为蝙蝠蛾拟青霉菌丝体发酵培养的重要指示性物质，因此，快速、有效的检测方法对于指导蝙蝠蛾拟青霉菌丝体发酵工艺研究具有重要的意义。

按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)中保健食品中腺苷的测定方法或《中国药典》(2010版)中金水宝胶囊中腺苷含量的测定方法是目前国内绝大多数工厂腺苷检测使用的方法。上述两种方法均采用直接超声的单一方式对腺苷进行提取，存在腺苷提取效率低的问题。并且，前者由于提取液为60％乙醇，极性较小，而蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷的极性相对较大，存在有效成分不能充分提取、腺苷含量测定不准确等问题，后者在进行液相色谱检测时，采用含2％四氢呋喃的磷酸盐缓冲溶液(0.066mol/L磷酸二氢钾：0.066mol/L磷酸氢二钠＝2：3)作为流动相，存在操作繁琐，流动相较为复杂，对仪器损耗大等问题，因此不能满足产品快速检验的要求。

通过对公开专利文献的检索，并未发现与本专利申请相同的公开专利文献，本专利申请涉及的蝙蝠蛾拟青霉，是从天然的冬虫夏草中分离得到，经中国科学院微生物研究所鉴定，确定为蝙蝠蛾拟青霉。将蝙蝠蛾拟青霉通过液体发酵培养，经过滤、烘干后，得到本发明所用的菌丝体干粉。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测快速、准确，有效成分提取效率高且流动相损耗小的蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法。

本发明解决其技术问题是通过以下技术方案实现的：

一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉中腺苷含量的快速检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

1)腺苷标准溶液配制：

称量腺苷标准品，用腺苷提取液溶解并定容，形成腺苷母液，用该腺苷母液配制成浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的腺苷标准溶液，备用；

2)样品溶液配制：

称取蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉样品0.5g，加入5mL腺苷提取液溶解混匀，加入50mg石英砂并研磨至糊状，冷却后转移至25mL比色管中并加腺苷提取液定容，用超声波振荡器超声振荡混合，在-20℃环境下冷冻再融化，反复冻融操作两次后冷却并转移至离心机中离心处理，取上清液经0.45um滤膜过滤，制成样品溶液，备用；

3)高效液相色谱法检测分析：

将上述腺苷标准溶液与样品溶液分别注入到液相色谱仪中进行液相色谱分析，以腺苷标准溶液的峰面积A为纵坐标，腺苷标准溶液浓度C为横坐标得到腺苷标准曲线A＝69117C+348.01，将相同时间内样品溶液的峰面积A’带入到腺苷标准曲线中，得到样品溶液中的腺苷含量C’，再根据样品溶液中腺苷含量计算得出蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉样品中的腺苷质量分数。

而且，步骤3)中所述腺苷质量分数w采用如下公式进行计算：

w＝(0.25C’/m)*100％

其中：C’为样品溶液中的腺苷含量，单位为mg/mL；

m为蝙蝠蛾拟青霉菌丝粉样品的质量，单位为g。

而且，所述的液相色谱条件为：

色谱柱：Waters Symmetry C185μm 4.6×150mm；

流动相：有机相为甲醇，水相为超纯水；

流速：1mL/min；

柱温：25℃；