[发明专利]大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法

说明书

本发明公开了一种大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：A、获取无菌外植体；B、获取无菌试管苗；C、增殖培养，增殖培养基为MS+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+1g/L活性炭+0.5‑2.0mg/L6‑苄基腺嘌呤+0.3‑0.5mg/L灵发素+0.2‑0.8mg·L吲哚丁酸；D、生根培养，生根培养基为1/2MS+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+1g/L活性炭+0.1‑1.0mg/L多效唑+0.1‑0.3mg/L吲哚丁酸+1.0‑2.0mg/L萘乙酸；E、炼苗与移栽。本发明具有外植体取材方便、操作步骤简单、培养时间短、增殖系数高和种苗质量好等优点。

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域。更具体地说，本发明涉及一种大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法。

背景技术

大叶紫金牛(Ardisia gigantifolia Stapf)又名走马胎、走马风，为紫金牛科紫金牛属植物，是民间常用的跌打损伤药。以根或全株入药，性温，味苦、微辛，具有祛风壮骨、活血化瘀、消肿止痛、止血生肌等功效，可治疗类风湿关节炎、筋骨疼痛、跌打损伤、产后瘀血、半身不遂、痈疽溃疡等。现代研究表明，大叶紫金牛富含三萜皂苷类、岩白菜素衍生物类、挥发油类等化合物，其中三萜皂苷类成分对多种肿瘤细胞活性都具有较强的抑制作用。大叶紫金牛是一种药食两用植物，人们在蒸炖食物时经常放入大叶紫金牛的根茎一起煮，可起到强身健体、提高免疫力的作用。此外，用大叶紫金牛的叶片煮水泡脚、洗澡等，还可去除疲劳和体内湿气。

近年来，大叶紫金牛的市场价格不断攀升，一株长有胎盘的大叶紫金牛植株能卖到150-200元。在巨大利益的驱动下，野生资源遭到过度采挖，濒临枯竭。因此，为了满足市场需求，人工种植势在必行。采用生物技术组织培养技术，可以有效快速地提高大叶紫金牛种苗的繁殖速度和质量，以满足生产上的需要。申请号为201510065908.5的中国专利“一种利用走马胎幼芽胚轴快速繁殖其种苗的方法”和申请号为201510522310.4的中国专利“一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法”公开了直接或间接利用大叶紫金牛的种子作为外植体进行组织培养的方法，然而，经科技人员多年研究发现，大叶紫金牛开花座果率不到5％，多数情况下得不到种子，好不容易得到的种子也要经过漫长的时间才能萌发，故上述2种方法均存在外植体取材困难的问题，严重阻碍了大叶紫金牛组培苗在人工栽培中的应用。申请号为201610266120.5的中国专利“一种利用走马胎叶片快速繁殖种苗的方法”，公开了利用走马胎叶片进行组织培养获得种苗的方法，但其存在转接次数多，步骤比较繁琐，获得大田移栽苗的时间长等问题。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法，其实现了大叶紫金牛组织培养外植体取材时间的周年性，且操作步骤简单，能够快速繁殖出大量适合大田移栽的大叶紫金牛优良种苗，有效提高了大叶紫金牛的种苗质量和增殖系数。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种大叶紫金牛叶片的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：

A、选择抽出新叶数量较多的大叶紫金牛单株，从中选择叶龄9-10天的新叶，截取茎尖部位的幼嫩叶片，经消毒处理后，切成0.8-1.0cm的小段，获得无菌外植体；

B、将步骤A得到的无菌外植体接种到诱导培养基中，在培养温度24-26℃，光照强度1500lux，光照时间10-12h/d的条件下培养25d，获到无菌试管苗；

C、将步骤B中得到的无菌试管苗切成1.0-2.0cm的小段，并接种到增殖培养基中，在培养温度24-26℃，光照强度1500lux，光照时间10-12h/d的条件下培养30d，获得不定芽，其中，所述增殖培养基是以MS为基本培养基，并添加30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭、0.5-2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.3-0.5mg/L的灵发素和0.2-0.8mg·L的吲哚丁酸，pH值为5.8；