[发明专利]一种检测环境中真菌毒素的方法

说明书

本发明公开了一种检测环境中真菌毒素的方法，包括：荧光染料标记aptamer识别探针，aptamer与待测真菌毒素配体特异结合，制备纳米颗粒修饰的捕获探针，未反应的aptamer探针与磁性纳米颗粒修饰的探针发生杂交反应；磁性分离，测定上清液中荧光信号强弱判断与aptamer结合的真菌毒素的量；对磁性分离后的杂交体，进行解链，水洗，再磁性分离，实现磁性纳米颗粒标记探针的再生。本发明的方法，整个检测过程时间短，操作步骤简单快捷，具体反应步骤没有用到大型仪器，较易于推广。可重复利用，节约资源，同时省去制备捕获探针的步骤，使得检测更加快捷简单，检测限低，特异性好，具有很好的实用性。

技术领域

本发明涉及真菌毒素检测技术领域，具体涉及一种检测环境中真菌毒素的方法。

背景技术

真菌毒素是特定的真菌或者霉菌产生的毒性次级代谢产物，可致癌、致畸、致突变，也可造成中毒性肾损害、肝细胞毒性、免疫抑制等，给人类的健康造成极大的威胁。目前真菌毒素的分析方法主要有薄层层析法(TLC)、气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)、液质联用(LC-MS)、气质联用(GC-MS)、高效液相色谱-荧光检测发(HPLC-FLD)、毛细管电泳法(CE)、免疫分析法等。色谱分析法灵敏度高，但是操作复杂、仪器昂贵，且需要专业人员实施，不能满足现场快速检测的需求。用于现场快速检测的方法主要为免疫分析法包括：胶体金快捷型(直接法)、胶体金精准型(萃取复溶法)及酶联免疫试剂盒Elisa，前两者只能定性分析，酶联免疫试剂盒操作相对复杂，检测样品范围较窄，不适合基层现场检测。而且基于免疫技术的方法抗体制备成本高，容易受到pH值、温度等环境因素的影响，也限制了其发展和应用。

分子生物学及分子遗传学的发展，使人们对真菌霉素的检测也从生化、免疫方法转向基因水平的检测。核酸适配体(aptamer)是近几年来通过体外筛选技术(指数富集的配体系统进化技术，Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。Aptamer与各种配体的结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性，它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠，形成一些稳定的三维空间结构：如发卡(hairpin)、假结(pseudoknot)、凸环(stem loop)、G-四分体(G-quartet)等。Aptamer可以通过范德华力、氢键作用、静电作用和形状匹配等各种相互作用与配体产生高特异性的结合力。Apatamer比蛋白质体积小、合成容易、稳定性更好，且拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度，成为近年来国内外研究者的热点，已在食品安全检测、环境检测、新药研发、临床诊断及毒理研究等领域展示了良好的应用前景。基于apatmer技术的真菌毒素检测也有了应用突破，目前研究者已经成功筛选了赭曲霉素A(OTA)、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、伏马菌素B1、玉米赤霉烯酮等真菌毒素的适配体序列。利用aptamer与配体的适应性识别的特性可以应用于真菌毒素检测前的前处理，该净化方法可有效地避免使用大量有机溶剂、排除其它物质干扰，再生时间短可以多次反复使用。基于aptamer技术和各种新型材料相结合的光化学、电化学真菌毒素的分析技术不断出现：如基于“Signal-off”、“Signal-on”模式的传感器用来检测食品中的真菌毒素，但是电化学传感器容易受到电流、电压信号的影响。

如何采用更好的方法或较为简单的仪器进行高灵敏度检测是目前研究的热门课题，荧光标记法是常用的方法，由于其背景低、检测灵敏度高，使基于该检测方法的aptamer也成为分子识别的研究重点。出现了基于适配体结构开关的生物荧光传感器、免疫标记分子信标荧光生物传感器等。