[发明专利]一种江珧贝壳DNA提取方法、鉴定引物及试剂盒

权利要求书

1.一种江珧贝壳DNA提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将江珧贝壳用去离子水浸泡冲洗后，用刷子洗刷干净，去掉表面的杂质及组织残留，置于电热鼓风干燥箱中65℃烘干6h，直到贝壳完全烘干；

(2)从江珧贝壳的腹缘取少量贝壳样本，用砂纸将贝壳样本的最外层磨掉，粉碎成粉末；

(3)过滤后的粉末转入灭菌的1.5ml EP管中，再加入1000μl的EDTA后，置于摇床中脱钙24小时，脱钙处理后将样品置于离心机中以4000rpm的转速离心15分钟，弃滤液，用50μl去离子水洗涤沉淀，以去除脱钙残留下来的盐离子；

(4)重复用50μl去离子水洗涤沉淀两次，然后加600μl、pH值为8.0的Tris-Hcl和20μl蛋白酶K，56℃温度条件下，消化6小时；

(5)加入600μl的抽提液，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，然后将上清液移至另一个1.5ml EP管中，再继续用等体积的抽提液再抽提一次，12000rpm离心10分钟，收集上层水相；

(6)加入600μl的氯仿，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，然后将上清液移至新的1.5ml EP管中，加入-20℃预冷的等体积的异丙醇，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，弃上清，然后用50μl，75％乙醇洗涤沉淀，重复洗涤一次；

(7)将EP管置于通风处晾干后，用5μl去离子水溶解DNA样品。

2.根据权利要求1所述的江珧贝壳DNA提取方法，其特征在于，步骤(2)中的粉碎成粉末的方法为：首先用锤子将贝壳样本砸碎，用镊子挑取贝壳内层的发亮片状棱柱层，置于经灭菌水清洗并烘干的研钵中，研碎成粉末，然后，用孔径为0.8mm的纱布过滤后得粉末。

3.根据权利要求1所述的江珧贝壳DNA提取方法，其特征在于，步骤(2)取贝壳样本的量为100mg。

4.根据权利要求1所述的江珧贝壳DNA提取方法，其特征在于，步骤(3)所述EDTA的pH值为8.0，摇床的温度为37℃，振荡速度为200rpm。

5.根据权利要求1所述的江珧贝壳DNA提取方法，其特征在于，步骤(5)中所述抽提液为苯酚-氯仿-异戊醇＝25∶24∶1。

6.根据权利要求1所述的江珧贝壳DNA提取方法，其特征在于，所述江珧贝壳为旗江珧或栉江珧贝壳。

7.用于权利要求6所述旗江珧贝壳鉴定的引物，其特征在于，所述引物包括如下3对引物对：

引物对1——正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；

引物对2——正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示；

引物对3——正向引物的序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.6所示。

8.用于权利要求6所述栉江珧贝壳鉴定的引物，其特征在于，所述引物包括如下3对引物对：

引物对4——正向引物的序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.8所示；

引物对5——正向引物的序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.10所示；

引物对6——正向引物的序列如SEQ ID NO.11所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.12所示。

9.包含权利要求7所述旗江珧或权利要求8所述栉江珧贝壳鉴定引物的试剂盒。