[发明专利]一种江珧贝壳DNA提取方法、鉴定引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及DNA提取技术领域，具体涉及一种江珧贝壳DNA提取方法、鉴定旗江珧或栉江珧引物及包含所述引物的试剂盒。

背景技术

江珧，在分类上属于双壳纲(Bivalvia)、贻贝目(Mytiloida)、江珧科(Pinnidae)，是一类经济价值较大的大型海产软体动物。江珧科是一个暖水性科，至今在世界上已发现约30种，主要分布在热带和亚热带海区。江珧的后闭壳肌肉嫩味美，营养丰富，干制品可以制成一种极为名贵的海珍品“江珧柱”。栉江珧与旗江珧是两种常见的经济种；栉江珧属栉江珧属，产量较大，壳形较长且壳薄，主要分布在日本、中国大陆、中国台湾等地区；旗江珧也属栉江珧属，壳中型到大型且壳厚，主要分布在印度、日本、菲律宾、印度尼西亚、波利尼西亚、非洲东部沿海等地区；二者形态差异较大。近年来，对江珧的研究工作逐步由研究其个体和种群转移到对其遗传学以及分子生物学的研究。

在进行分子育种以及群体遗传学研究中，通常需要对个体进行基因序列分析，以获得相关的遗传信息。对于分子生物学的研究，首要任务就是提取高质量的DNA，提取DNA的质量对于后期的研究分析以及育种筛选具有重要的影响。DNA的提取过程是从个体本身获取一定的组织，将细胞粉碎，去除与DNA结合的蛋白质、多糖和脂类，最终通过分离纯化得到所需的DNA。

对于软体动物而言，传统的DNA提取方法是是剖取软体动物部分组织，进行DNA的提取。但是，这种方法对软体动物个体具有较大的伤害，剖取组织后对个体伤害较大，导致个体的成活率很低，对后续软体动物个体的观察以及发育有较大的影响，并且具有很大的死亡比例。所以，活体取样组织进行DNA的提取，并不是软体动物无损伤提取DNA进行基因序列分析的最佳手段。

目前，贝类的分子育种工作尚未开展，其中一个主要困难就是种贝的活体取样工作难以有效开展。首先，因为大多数贝类具有以保护其软体部的坚硬外壳，并且非常不易打开，这给取样造成了困难；其次，部分贝类(如扇贝)的双壳虽然会经常打开，但软体部取样后也往往具有较高的死亡率，不利于种贝资源的养护和利用；因此，寻找到高效、适宜的贝类活体基因组DNA提取方法，可为贝类分子育种和分子鉴定奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种江珧贝壳DNA提取方法，该方法只利用江珧贝壳少量的腹缘贝壳，就成功提取到了江珧线粒体基因组和核基因组，这种方法对贝壳的软体无损伤，为贝类分子育种中个体基因和基因型的分子检测提供了可靠途径。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种江珧贝壳DNA提取方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将江珧贝壳用去离子水浸泡冲洗后，用刷子洗刷干净，去掉表面的杂质及组织残留，置于电热鼓风干燥箱中65℃烘干6h，直到贝壳完全烘干；

(2)从江珧贝壳的腹缘取少量贝壳样本(约100mg)，用砂纸将贝壳样本的最外层磨掉，粉碎成粉末；

(3)过滤后的粉末转入灭菌的1.5ml EP管中，再加入1000μl的EDTA后，置于摇床中脱钙24小时，脱钙处理后将样品置于离心机中以4000rpm的转速离心15分钟，弃滤液，用50μl去离子水洗涤沉淀，以去除脱钙残留下来的盐离子；

(4)重复用50μl去离子水洗涤沉淀两次，然后加600μl、pH值为8.0的Tris-Hcl和20μl蛋白酶K，56℃温度条件下，消化6小时；

(5)加入600μl的抽提液，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，然后将上清液移至另一个1.5ml EP管中，再继续用等体积的抽提液再抽提一次，12000rpm离心10分钟，收集上层水相；

(6)加入600μl的氯仿，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，然后将上清液移至新的1.5ml EP管中，加入-20℃预冷的等体积的异丙醇，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，弃上清，然后用50μl，75％乙醇洗涤沉淀，重复洗涤一次；

(7)将EP管置于通风处晾干后，用5μl去离子水溶解DNA样品。

其中，步骤(2)中的粉碎成粉末的方法为：首先用锤子将贝壳样本砸碎，用镊子挑取贝壳内层的发亮片状棱柱层，置于经灭菌水清洗并烘干的研钵中，研碎成粉末，然后，用孔径为0.8mm的纱布过滤后得粉末。

进一步地，步骤(3)所述EDTA的pH值为8.0，摇床的温度为37℃，振荡速度为200rpm。

进一步地，步骤(5)中所述抽提液为苯酚-氯仿-异戊醇＝25∶24∶1。

以上方法适合所有的江珧贝壳，尤其适用于旗江珧或栉江珧贝壳。