[发明专利]一种提高蛹虫草菌液体发酵虫草素产量的方法

权利要求书

1.一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，其特征在于：用中国微生物菌种保藏中心的蛹虫草菌（Cordyceps militaris）CGMCC3.4655；按照下述步骤进行：

（1）将菌株转接于无菌PDA斜面培养基上进行培养、活化，制得斜面母种；

（2）将斜面母种转接至平皿培养基培养，制得平板母种；

（3）将平板母种接种至种子培养基，摇床培养，制得种子液；

（4）将种子液接种至优化培养基并用无菌聚丙烯袋封住三角瓶口，于黑暗、25℃、160r/min摇床培养，制得待补料发酵液；优化培养基中腺嘌呤和甘氨酸的质量浓度分别为2g/L和14g/L并且均为优化质量浓度；向待补料发酵液添加腺嘌呤补料溶液的时间点为摇床培养第12d；

（5）依据腺嘌呤补料公式配制腺嘌呤补料溶液，向待补料发酵液添加100mL腺嘌呤补料溶液,使得发酵液腺嘌呤达到其优化质量浓度，制得已补料发酵液；其中，腺嘌呤补料公式为ρ=（V_c*ρ_c+V₀*ρ₀）/（V_c+ V₀），该腺嘌呤补料公式中，ρ为腺嘌呤的优化质量浓度2 g/L，ρ₀为腺嘌呤补料溶液质量浓度，V₀为每个待补料发酵液中添加腺嘌呤补料溶液的体积100mL，ρ_c和V_c分别为第12d待补料发酵液腺嘌呤剩余量和发酵液体积；

（6）将已补料发酵液于黑暗、25℃、160 r/min条件下摇床培养6d后，继续在黑暗、25℃条件下静置培养6d，静置培养结束后制得含菌丝体的发酵液；

（7）将含菌丝体的发酵液中的菌丝体滤除，收集滤液，制得虫草素发酵滤液。

2.如权利要求1所述的一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，其特征在于：步骤（2）所述的平皿培养基，其组方为：由蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g与琼脂15g组成的营养琼脂33g与纯净水1000mL混匀， pH7.3±0.1；方法为：从斜面母种取3mm大小菌块，接种至平皿培养基，于黑暗、20℃培养9d，制得平板母种。

3.如权利要求1所述的一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，其特征在于：步骤（3）所述的种子培养基，其组方为：葡萄糖30g、蛋白胨8g、酵母粉8g、KH₂PO₄ 1g与水1000mL混匀，pH自然；方法为：无菌条件下用打孔器取平板母种同一半径上3 mm大小的6个菌块接种至种子培养基装载量为300mL/500mL的三角瓶中，于25℃、黑暗、120 r/min 摇床培养3d制成种子液。

4.如权利要求1、2或3所述的一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，其特征在于：步骤（4）所述的优化培养基，其组方为：葡萄糖35 g、蛋白胨17 g、腺嘌呤2 g、甘氨酸14g、KH₂PO₄ 1 g、MgSO₄·7H₂O 1 g与纯净水1000mL混匀， pH自然；方法为：无菌条件下将10mL的种子液接种至装有200mL无菌优化培养基、体积为500mL的三角瓶中，用无菌聚丙烯袋封住三角瓶瓶口。

5.如权利要求4所述的一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，其特征在于：步骤（5）所述的已补料发酵液制作中，腺嘌呤补料参数为：腺嘌呤补料溶液的质量浓度按照腺嘌呤补料公式计算，每个待补料发酵液添加腺嘌呤补料溶液的体积为100mL；方法为：将步骤（4）装有待补料发酵液的三角瓶从摇床取出并置于超净工作台，无菌条件下，取下三角瓶瓶口的聚丙烯袋和瓶塞后，将装载量100mL/150mL的无菌腺嘌呤溶液倒入待补料发酵液，制成已补料发酵液。

6.如权利要求1所述的一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，其特征在于：所述步骤（7）的虫草素发酵滤液制作方法为：含菌丝体的发酵液经0.22µm滤膜滤除菌丝体，收集滤液，即得虫草素发酵滤液。