[发明专利]一种提高蛹虫草菌液体发酵虫草素产量的方法

说明书

一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，步骤为：将菌株转接于无菌PDA斜面培养基上进行培养、活化，得斜面母种；斜面母种转接至平皿培养基培养，得平板母种；平板母种接种至种子培养基，摇床培养，得种子液；种子液接种至优化培养基并用无菌聚丙烯袋封住三角瓶口，摇床培养，得待补料发酵液；依据腺嘌呤补料公式配制腺嘌呤补料溶液，向待补料发酵液添加100mL腺嘌呤补料溶液,使得发酵液腺嘌呤达到其优化质量浓度，得已补料发酵液；将已补料发酵液于摇床培养后，继续静置培养，得含菌丝体的发酵液；将含菌丝体的发酵液中的菌丝体滤除，得虫草素发酵滤液。其工艺简单、无污染、虫草菌发酵液虫草素产量高达956.020µg/mL。

技术领域

本发明涉及真菌发酵技术领域，具体地说是一种提高蛹虫草菌液体发酵虫草素产量的方法。

背景技术

虫草素（Cordycepin）即3’脱氧腺苷，为嘌呤类生物碱，具有抗病毒、消炎、抑制肿瘤和提高机体免疫力等功效。此外，虫草素通过ROS介导的细胞凋亡途径治疗T淋巴细胞白血病，其作为治疗T淋巴细胞白血病新药的研究已进入临床二期实验。而虫草素的产生菌主要为虫草属真菌，此外，无冠构巢曲霉亦可产生虫草素，但蛹虫草菌Cordyceps militaris发酵液中虫草素含量高于其他真菌。

近年来，温度、光照、溶氧量、pH值、碳氮源等提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的研究很多，但利用微量添加物的补料策略提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的研究很少，而腺嘌呤和腺苷为虫草素生物合成的直接前体物质，对提高发酵液虫草素产量的作用显著，腺嘌呤比腺苷更容易通过细胞膜，使得细胞利用腺嘌呤合成虫草素的效率更高。然而，优化腺嘌呤补料策略提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的研究更少。如专利申请号为201610578793.4的中国发明专利申请所公开的《一种提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素产量的方法》、《食品科技,》2013, 38（7）所公开的《甘氨酸补加产虫草素的蛹虫草液体发酵条件的优化》均未进行腺嘌呤的补料，发酵液虫草素产量的提高程度较低，最高只有238.52％。专利申请号为200810069010.5的中国发明专利申请所公开的《一种提高蛹虫草液体发酵虫草菌素产量的方法》联合添加腺嘌呤和甘氨酸，使得虫草素产量比对照提高了426%，但没有优化腺嘌呤和甘氨酸的联合添加浓度，同时也未进行腺嘌呤的补料。专利申请号为201510233106.0的中国发明专利申请公开了《一种虫草素发酵固体培养基及其制备方法与应用》，采取联合补料腺嘌呤和脂肪酸甘油酯提高固体培养基蛹虫草素产量，即未优化腺嘌呤的联合添加浓度，也未依据腺嘌呤的优化浓度进行精确补料，而且其采用的添加方式易造成发酵污染，进而影响虫草素产量的提高，增加了生产成本。专利申请号为201611245510.0、名称为《一种提高蛹虫草液态发酵生产虫草素和耐热蛋白酶产量的方法》的中国发明专利申请，利用营养液和复合激活剂多次补料以提高虫草素产量，但未对复合激活剂组分的添加浓度进行优化，亦未根据复合激活剂的优化浓度进行补料，易增加生产成本且工艺较复杂。

资助本发明的项目：1、甘肃省青年科技基金计划项目（17JR5RA181）“高产虫草素蛹虫草菌的诱变选育研究 ”；2、甘肃省科学院应用研究与开发项目（2017JK-14）。本发明深入研究了提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，并获得成功。

发明内容

本发明旨在提供一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，克服现有技术蛹虫草菌发酵液虫草素产量提高程度低、补料不精准、补料易污染和补料工艺复杂的技术缺陷。

一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，其特征在于：使用的菌株为中国微生物菌种保藏中心的蛹虫草菌（Cordyceps militaris）CGMCC3.4655；按照下述步骤进行：

（1）将菌株转接于无菌PDA斜面培养基上进行培养、活化，制得斜面母种；

（2）将斜面母种转接至平皿培养基培养，制得平板母种；