[发明专利]一种制备异枝江蓠原生质体的方法

权利要求书

1.一种制备异枝江蓠原生质体的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

1)样品挑选：选取健康、无损伤的异枝江蓠，清洗异枝江蓠表面备用；

2)样品处理：将1)中清洗过的异枝江蓠截取尖端3厘米后进行处理，消除异枝江蓠表面的杂藻及有害微生物；

3)琼胶酶粗酶液制备：培养海洋细菌Marinomonas sp.YS-70，用2％的接种量接种在2216E发酵培养基中，在26℃下120r/min震荡培养48小时后，取发酵液在4℃下离心30分钟，取上清液作为琼胶酶粗酶液，储存在-80℃冰箱中；

4)原生质体分离液的制备：将MES-Tris和CaCl₂·2H₂O加入去离子水中配置成浓度为25mM的基液，然后把基液与步骤3)所得琼胶酶粗酶液按体积比4:6混合，再在混合液中加入2％w/v的纤维素酶干粉，1％w/v的离析酶干粉和0.4M山梨醇；

5)原生质体的制备：将步骤2)处理后的异枝江蓠切成2-3毫米大小，再用消毒海水冲洗多次，将步骤4)所得原生质体分离液加入异枝江蓠中，每1g异枝江蓠中加入10mL原生质体分离液，在pH 6.5，28℃下，90r/min摇床上遮光酶解4小时，酶解后用45μm的尼龙网进行过滤，取滤液在25℃下离心处理后弃掉上清，加含0.6M山梨醇的MES培养液重悬原生质体，重复离心处理多次。

2.根据权利要求1所述制备异枝江蓠原生质体的方法，其特征在于，步骤2)对样品的处理包括：用消毒海水培养5天，用超声波清洁仪处理3分钟，然后浸泡于1.5％KI中10分钟，用消毒海水冲洗多次后浸泡于抗生素溶液中48小时。