[发明专利]一种制备异枝江蓠原生质体的方法

说明书

本发明公开了一种制备异枝江蓠(Gracilaria bailinae)原生质体的方法，本发明的方法通过培养海洋细菌Marinomonas sp.YS‑70发酵产生琼胶酶粗酶液，混合纤维素酶、离析酶及添加缓冲介质和渗压剂组成原生质体分离液，对经过消毒、切碎的异枝江蓠藻体进行酶解处理，使其释放出游离原生质体。本发明采用异枝江蓠原生质体的分离的琼胶酶，其中包含多种酶活性，产量多，能够使细胞壁解离充分，成本低而且高效。离析酶与纤维素酶和琼胶酶互相配合起协同作用，效率高，所需时间短，仅需要解离4h，可得到大量的原生质体，有利于提高原生质体的产量及其存活率。解离后原生质体活性强，后续的培养存活率高及细胞壁再生能力强。而且本发明的异枝江蓠不需要预处理，有利于节省成本。

技术领域

本发明涉及一种制备大型海藻的原生质体的方法，特别涉及一种制备异枝江蓠原生质体的方法。

背景技术

异枝江蓠(Gracilaria bailinae)是我国南方沿海的一种经济海藻，可作为鲍鱼的饵料和提取琼胶的原料。有报道发现异枝江蓠适合生长的温度为23～33℃，适合生长的盐度为18～28，有适应广温和广盐的性质。具有氮高效利用的营养特征，由于其具有生长快、有耐受广温和广盐等特性，近年来已经在我国广东、福建等地进行栽培。

异枝江蓠的生活史是，四分孢子体成熟后在皮层细胞形成许多四分孢子囊，且每个四分孢子囊中有四个经减数分裂产生的四分孢子。四分孢子放散之后，发育成雌、雄配子体。雌配子体性成熟后形成果孢，雄配子性成熟之后形成精子囊，大量的精子从精子囊释放后游离到雌配子体上，然后生殖细胞结合形成合子，合子在雌配子体的表面发育出凸起的囊果，即形成果孢子体。果孢子体成熟后放散并发育成四分孢子体，完成世代交替的生活史。

由于目前异枝江蓠的栽培生产是采用传统方式进行种质保存和培养，即采用藻体进行营养繁殖，这种方法需要耗费大量藻体作为种苗，且这些种苗若保存在室内，则因为保存数量有限，难以实现大规模生产栽培，若保存在海区，则种苗容易受到自然环境的影响，苗种产量难以进行控制，因此需要建立起异枝江蓠苗种培育技术体系，以应用于栽培生产。

原生质体的分离、培养再生是植物组织培养技术中的两种重要的手段，利用原生质体再生的方法快速繁殖植物，已在高等植物生产应用上取得成效。在大型海藻方面，只有将常规育苗技术改变成为细胞工程育苗技术，能建立良种保存、扩繁、育苗和栽培的良种化技术体系，实现海藻的良种化生产，这也将成为今后大型海藻人工栽培发展的新趋势。本发明技术对异枝江蓠建立一种可行的种质保存和组织培养的技术体系，开发苗种培育新技术，满足栽培生产对苗种的需要，对利用江蓠原生质体再生、融合等细胞工程技术进行江蓠属海藻的育种研究，均具有重要意义。

江蓠的细胞壁主要由纤维素和琼胶组成，其中纤维素是同多糖，通过购买的较纯的纤维素酶很容易将细胞壁中的纤维素降解，但琼胶的组成成份很复杂，它由琼脂糖和硫琼胶组成,琼胶糖是由1,3连接的β-D-半乳吡喃糖和1,4连接的3,6-内醚-α-L-半乳吡喃糖残基反复交替连接的直链聚合物，结构较均一,凝胶强度高。硫琼胶由长短不一的半乳糖残基多糖链组成,结构较复杂,其中包含有D-半乳糖、3,6-半乳糖酐、半乳糖醛酸和多种取代基如丙酮酸、硫酸基、甲基等，是琼脂结构中的非凝胶组分，其结构很不均一,凝胶强度低。由于江蓠的种类、生长环境和采集季节等的不同，其细胞壁中的多糖和其他物质的含量和种类也会相应变化，所含琼胶的数量及其物理化学性质变化很大，有的产琼胶率高、质量好，有的则很差。不同种江蓠的细胞壁中的琼胶含量与琼胶的凝胶强度不一样，故在降解相应的江蓠的细胞壁时，所选用的琼胶酶是关键，故在分离它们的原生质体的时候需要采用不同的手段。目前市场上卖的琼胶酶一般是经过纯化的，不能有效降解细胞壁，从而使原生质体不释放或释放量少，而且商品琼胶酶价格昂贵，成本高。