[发明专利]一种利用D‑阿拉伯糖生产D‑1,2,4‑丁三醇的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

D-1,2,4-丁三醇(专利中涉及2种(D-1,2,4-Butanetriol，简称BT)是一种重要的四碳多元醇，无色、无味、透明的溶于水是粘稠糖浆类液体。其性质和丙三醇(甘油)类似，具有一定的吸湿性和稳定性。D-1,2,4-丁三醇及其衍生物是许多化合物的重要的底物及合成的前体。在军事上丁三醇可以用来合成丁三醇三硝酸酯(BTTN)，它是一种高效的推进剂和增塑剂。在医药上，能合成降胆固醇的药物Movinolin、抗癌药物、还可以用于治疗艾滋病药物Agenerase(一种HIV蛋白酶抑制剂)。在烟草行业，可以作为卷烟添加剂，可以降低焦油对人体的伤害。另外，D-1,2,4-丁三醇还可以用于高级服装的处理，以及抑菌剂和高分子交联剂等。

目前丁三醇的生产主要采用NaBH₄还原苹果酸二酯或铷和碳催化苹果酸加氢等相关方法使用不同的催化剂在19.7～34.0MPa的H₂压力下和60～160℃的条件下，可将苹果酸以60％～80％的转化率转化为1,2,4-丁三醇。然后由于化学合成法存在原料成本高、产物转化率低、反应条件严苛、生产危险大、副产物多、环境污染严重等问题，随着近年来生物技术的发展以及1,2,4-丁三醇市场的快速增长，人们开始关注原料成本低廉、反应条件温和、对环境友好且安全高效的生物合成1,2,4-丁三醇的技术途径。

Wei Niu等首次报道了在大肠杆菌(Escherichia coli)中构建了异源代谢途径，随后由E.coli DH5α/p WN6.186A(表达了苯甲酰甲酸脱羧酶基因的工程菌)经三步催化反应生成D-BT，摩尔转化率为25％，利用D-木糖酸和L-阿拉伯糖酸为底物合成1,2,4-丁三醇对映体，产量为2.4g/L。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌，以解决现有技术中D-1,2,4-丁三醇生产转化率低、产量少的问题。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌在生产D-1,2,4-丁三醇中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌，在宿主菌中表达D-阿拉伯糖脱氢酶、D-阿拉伯糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。D-阿拉伯糖在D-阿拉伯糖脱氢酶作用下生成D-阿拉伯糖酸，之后在D-阿拉伯糖酸脱水酶作用下生成3-脱氧-D甘油戊酮糖酸，在2-酮酸脱羧酶作用下生成3，4二羟基丁醛，最后在醇脱氢酶作用下生成D-1，2，4丁三醇。

作为优选，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

作为优选，所述的D-阿拉伯糖脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，D-阿拉伯糖酸脱水酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，2-酮酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)将D-阿拉伯糖脱氢酶、D-阿拉伯糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶克隆到表达质粒中，得到重组质粒；

(2)将重组质粒转化宿主菌，既得到利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌。

步骤(1)中，所述的表达质粒为PRSF-duet-1或PET-duet-1。

步骤(2)中，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

步骤(1)中，将D-阿拉伯糖脱氢酶、D-阿拉伯糖酸脱水酶同时克隆到PRSF-duet-1质粒中得到重组质粒A，将2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶同时克隆到PET-duet-1质粒中，得到重组质粒B，将重组质粒A和重组质粒B同时导入宿主菌中。

上述利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法构建得到的利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌在本发明的保护范围之内。

上述利用D-阿拉伯糖生产D-1,2,4-丁三醇的基因工程菌在生产D-阿拉伯糖中的应用。

有益效果：