[发明专利]一种黄花白芨的鉴别方法有效
| 申请号： | 201710986339.7 | 申请日： | 2017-10-20 |
| 公开（公告）号： | CN107523644B | 公开（公告）日： | 2021-01-26 |
| 发明（设计）人： | 刘红美;张洁;刘显义;张婷婷;曾丽娜 | 申请（专利权）人： | 贵州医科大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895 |
| 代理公司： | 贵阳索易时代知识产权代理事务所(普通合伙) 52117 | 代理人： | 管宝伟 |
| 地址： | 550025 贵*** | 国省代码： | 贵州;52 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 黄花 白芨 鉴别方法 | ||
1.一种黄花白芨的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、挑选种植时间相同的黄花白芨和紫花白芨各3株，采用CTAB方法分别抽提个体基因组DNA；
b、设计引物分别对3株紫花白芨DNA和3株黄花白芨DNA的核糖体大亚基基因的D1-D3区DNA序列进行扩增、克隆、测序和序列比对，当3株紫花白芨和3株黄花白芨都出现SNP位点时，确定该待测SNP位点；
所述引物为DUAN5：5'-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3'；DUNA6：5'-GGCATAGTTCACCATCTTTC-3'；所述扩增产物大小为760bp；
所述SNP位点位于白芨核糖体大亚基基因的D1-D3区DNA序列扩增产物的637bp处和642bp处，其中黄花白芨在这2个位点碱基分别为C、G，紫花白芨为T、A；
c、针对SNP位点设计特异性的PCR扩增引物，将PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的3'末端对应待测SNP进行扩增，验证该SNP位点，得出SNP位点标准基因数据；所述SNP位点验证方法为设计如下特异引物：DUAN5：5'-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3'，JDHH：5'-TTATCAGCTTCCTTGCGCCG-3'；扩增引物中反向引物的3'末端对应第一个待测SNP，扩增产物大小为650bp；
d、采用PCR扩增引物对待测样本的DNA进行扩增，并根据扩增产物在PCR扩增电泳图中目的条带的有无确定待测样本SNP位点基因型，将此基因与标准基因数据相比较，从而判定待测样品是黄花白芨还是紫花白芨；
所述PCR扩增的条件为：预变性温度94℃，时间5min；变性温度94℃，时间1min；退火温度54℃，时间45s；延伸温度72℃，时间1min；按此条件循环30次，最后在72℃时延伸10min，4℃温度下冷藏保存；
所述PCR扩增的体系为30μL体系，其中5×Taq buffer 6μL，dNTPs2.4μL，上下游引物各1μL，引物终浓度0.4μM；模板1μL，模板终浓度约60ng；Taq酶0.15μL，加ddH2O至30μL。
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