[发明专利]一种厌氧氨氧化菌的真空冷冻干燥保藏及复壮的方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种厌氧氨氧化菌的真空冷冻干燥保藏及复壮的方法，属于含氮废水生物处理技术领域，特别涉及能够保持厌氧氨氧化菌活性的长期保藏方法并将保藏厌氧氨氧化菌作为种泥投加的迅速活性恢复方法。

背景技术

厌氧氨氧化(anammox)作为一种新型生物脱氮工艺，以NH₄⁺-N为电子供体，NO₂^--N为电子受体^[1]，[1].Strous,M.,J.G.Kuenen and M.S.Jetten,Key physiology of anaerobic ammonium oxidation.Appl Environ Microbiol,1999.65(7):p.3248-50.并产生氮气，可实现两种氮素污染物的同时去除^[2]。[2].van de Graaf,A.A.,et al.,Anaerobic oxidation of ammonium is a biologically mediated process.Appl Environ Microbiol,1995.61(4):p.1246-51.由于anammox不需氧气与有机物参与反应，无需曝气和外加有机碳源，能耗低于传统的生物脱氮工艺。被认为是目前最经济的生物脱氮工艺之一，其应用前景广阔。但是厌氧氨氧化菌生长缓慢，倍增时间长达14天，导致厌氧氨氧化工艺难以启动。近年来有研究表明，增大前期接种量或增加后期菌种流加频率可解决anammox的启动缓慢的问题^[3]。[3].唐崇俭等,基于基质浓度的厌氧氨氧化工艺运行策略.化工学报,2009.60(3):第718-725页.但是这两种方法需要大量的优质的厌氧氨氧化菌作为种泥，因此能够保持厌氧氨氧化菌活性的保藏方法以及保藏的厌氧氨氧化菌作为种泥投加后活性迅速恢复的复壮方法是一个值得研究的课题。

菌种保藏技术是通过人为创造一个干燥、低温、缺氧的环境，通过添加适当保护剂，抑制微生物的代谢，经长期保藏后保持菌种一定的存活率，保证菌种活性较快恢复。微生物保存方法主要有两种：第一种为常规保存法，包括半固体穿刺、石蜡等方法；第二种为添加保护剂低温保存，包括冷冻法、冷冻干燥法等。目前厌氧氨氧化菌的保存方法多为-200℃液氮冷冻干燥法、-20℃～-80℃的冷冻法，这些方法存在诸如不安全、能耗较高且菌种活性恢复较差；4℃冷藏法也有众多研究，但是其保藏的时间较短，通常用于实验室规模的短期保存。而采用真空冷冻干燥法具有保藏期长，存活率高,变异率低等特点，是目前厌氧菌常用的一种保藏方法。但是并无厌氧氨氧化菌利用真空冷冻干燥法保藏的相关报道。

厌氧氨氧化菌对环境条件敏感决定了需要寻求一种长远高效的保藏方法。在进行干法保藏时，需考虑保护剂选择、保护剂添加比例、保藏时间及活性恢复措施对厌氧氨氧化菌保藏效果的影响。

发明内容

本发明针对目前厌氧氨氧化保藏技术的不足，提出了一种采用真空冷冻干燥法进行厌氧氨氧化菌干法长期保藏以及保藏菌种复壮过程优化方法。真空冷冻干燥保藏方法操作简便、保藏期长、获得菌粉降低了运输和储藏成本，优化后的复壮方法使菌种活性恢复速度快、活性恢复程度较高，能实现较高的脱氮性能。因此该专利能够实现厌氧氨氧化菌长期保藏及工业化应用的目标。

本发明的技术方案：

一种厌氧氨氧化菌的真空冷冻干燥保藏方法，步骤如下：

(1)对待保藏的厌氧氨氧化混培物，在6000rpm条件下离心10min后，弃置上清液；再加入0.2M磷酸盐缓冲溶液、混匀，离心去除上清液，重复多次，得到厌氧氨氧化菌沉淀物；

(2)将步骤(1)得到的厌氧氨氧化菌沉淀物置于经灭菌处理后的培养皿中，再向培养皿中加入二甲基亚砜，混匀，混合过程进行氮气吹扫；其中，二甲基亚砜的添加量为混合物总质量的3％；

(3)将步骤(2)得到的混合物置于-20℃条件下预冻；

(4)将上述装有待保藏菌体的表面皿置于真空冷冻干燥机中，在温度-92℃、真空度5Pa条件下，冷冻干燥，得到干菌粉；

(5)将步骤(4)获得的干菌粉转移真空袋后，经真空密封后放入4℃避光保藏。

一种优化的保藏菌种复壮方法，步骤如下：

(1)保藏期结束后，向干菌粉加入0.2MPBS，混匀，离心去除上清液，重复多次，得到厌氧氨氧化沉淀物；向厌氧氨氧化沉淀物中加入基质溶液，曝氮气脱氧后放入4℃冰箱中使细胞补水24h；