[发明专利]用于核酸合成和扩增的组合物、方法和试剂盒

说明书

本发明涉及用于合成核酸分子的组合物、方法和试剂盒。更具体地，提供了用以在单步骤RT‑PCR法中扩增核酸分子的组合物、方法和试剂盒，其包括用于增强对PCR抑制剂的耐受性的一种或多种试剂。

本申请是201180037898.4的分案申请。

相关申请的交叉参考:

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2010年6月21日提交的美国临时专利申请号61/357,021和2011年3月25日提交的美国临时专利申请号61/467,852的优先权的利益，将所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。

领域:

本公开内容涉及用于合成核酸的组合物、方法和试剂盒。更具体地，提供了用于在单步RT-PCR法中扩增核酸分子的组合物、方法和试剂盒，其包括一种或多种用于增强对PCR抑制剂的耐受性的试剂。

背景:

核酸的检测、分析、转录和扩增是现代分子生物学中最重要的方法中的一些方法。此类方法用于核酸分析的应用在基因表达的研究、感染性试剂或遗传疾病的诊断、cDNA的产生和逆转录病毒的分析等等应用中特别重要。逆转录RNA，随后通过聚合酶链式反应(PCR)进行cDNA扩增，通常称为RT-PCR或RNA-PCR，已被广泛用于检测和定量核酸靶并且对于病毒基因分析特别重要。

致癌病毒及其在癌症的病理发生中的作用的研究可在癌症的诊断和治疗中具有重要意义。然而，致癌病毒的检测中的可变性可使这些研究成为挑战性的。检测法的灵敏性和特异性是关键问题。早期检测可通过使用分子生物学技术检测还未经历血清转换的样品中的致癌病毒核酸来实现，此类技术适用于不能在组织培养中繁殖的病毒。常规地，免疫检测法已被用于检测致癌病毒的存在，但此类方法具有几个缺点。在人乳头瘤病毒(HPV)(其可引起宫颈癌)的情况下，检测因早期病毒蛋白质的低表达和可区分HPV类型的的灵敏且特异的高质量抗体的缺乏而十分困难(Villa and Denny,International Journal ofGynecology and Obstetrics,94(Suppl.1):S71-S80(2006))。当样品因可以在样品收集之前已发生数目或数年的感染(如在爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的情况下)而显示残余的抗体水平时，结果还可引起误导或不能得出结论，所述爱泼斯坦-巴尔病毒与何杰金淋巴瘤及其它癌相关(国家传染病中心(National Center for Infectious Diseases)。“爱泼斯坦-巴尔病毒和传染性单核细胞增多症”，CDC.http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/ebv.htm(2010年11月))。病毒核酸的基于PCR的检测不仅因序列特异性引物结合而具有高度特异性的有利方面，而且其还因为其扩增更短的核酸片段的能力而比其它杂交技术例如Northern和Southern印迹那样麻烦比它们更灵敏。序列特异性探针结合给实时PCR添加了额外层的特异性并且具有提供病毒载量信息的额外有利方面。

RT-PCR通常包括两个单独的分子合成：(i)cDNA从RNA模板的合成；和(ii)新合成的cDNA通过PCR扩增的复制。可使用两种或更多种酶，通过单步(或偶联)RT-PCR法进行RT-PCR，其中将至少两种单独的酶(例如，逆转录酶和聚合酶)分别用于初始cDNA合成和随后的扩增。

在单步RT-PCR中，将逆转录和PCR扩增组合至单个反应混合物中，这提供了优于两步骤RT-PCR(其中使用两个不同的或单独的反应进行合成和扩增步骤)的众多有利方面。单步骤RT-PCR需要比二步骤RT-PCR更少的对于反应混合物和核酸产物的操作(例如，两个反应步骤之间为了添加组分或酶而进行的反应管的打开)，从而是劳动密集度较低并且耗时较少的方法。必要时，单步骤RT-PCR还允许使用更少的样品，以及减小污染的风险(Sellner和Turbett,Biotechniques25:234-238(1998))。