[发明专利]一种用于微滴式核酸绝对定量标定的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于微滴式核酸绝对定量标定的内标物，其特征在于，所述内标物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或为SEQ ID NO.1所示序列的互补序列。

2.一种用于微滴式核酸绝对定量标定DNA的通用试剂盒，其特征在于，其包括核苷酸如SEQ ID NO.1所示的内标物、如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的内标引物及如SEQ ID NO.4所示的内标探针。

3.如权利要求2所述的通用试剂盒，其特征在于，所述内标探针的5‵端标记荧光基团，3‵端标记猝灭基团；其中，荧光基团可采用HEX、FAM、JOE、CY3、ROX、CY5等中的任一种；猝灭基团可采用BHQ1、BHQ2、MAX等中的任一种。

4.如权利要求2所述的通用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：高效酶和稳定剂。

5.如权利要求2所述的通用试剂盒，其特征在于，所述高效酶包括终浓度为0.07～0.12μg/μL的gP32、0.1～0.15μg/μL的RecA、0.01～0.05μg/μL的Bsu DNA polymerase、1～3Unit/uL的ExoI、0.05～0.15μg/μL的CKMM、0.1mol/L的Tricine；

所述稳定剂PEG(聚乙二醇)-6000的化学结构为HO(CH₂CH₂O)_nH，n＝5～5.75，浓度为0.2mg/μL。

6.如权利要求5所述的通用试剂盒，其特征在于，所述高效酶包括终浓度为0.09μg/μL的gP32、0.12μg/μL的RecA、0.03μg/μL的Bsu DNA polymerase、2Unit/uL的ExoI、0.1μg/μL的CKMM、0.1mol/L的Tricine；

所述稳定剂PEG(聚乙二醇)-6000的化学结构为HO(CH₂CH₂O)_nH，n＝5～5.75，浓度为0.2mg/μL。

7.如权利要求2所述的通用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：DG8微滴发生卡、微滴发生卡胶条、96孔板、铝膜、微滴生成油、2Xcontrol buffer、核酸标定Supermix，所述核酸标定Supermix中包括有所述内标引物和内标探针。

8.如权利要求2-7中所述的通用试剂盒，其特征在于，所述核酸标定Supermix包括：1X ddPCR supermix；内标的上下游引物；内标探针；高效酶和稳定剂。

9.如权利要求2-7中所述的通用试剂盒，其特征在于，所述核酸标定Supermix包括：终浓度分别为1X ddPCR supermix；900nM的内标的上下游引物；250nM内标探针；0.5Unit/μL的高效酶；5μg/μL的稳定剂。

10.如权利要求2-9中任一项所述通用试剂盒的使用方法，其特征在于，将所述的内标物和待检测的样本，按1：1混合后提取的核酸，取提取后核酸与待测样本的上下游引物、待测样本的探针和核酸标定Supermix，配成ddPCR反应液上绝对定量平台检测，同时直接将内标物和核酸标定Supermix配成ddPCR反应液上绝对定量平台检测；

检测结果计算方式：将内标物和待测样本按1：1混合后提取的核酸进行检测，内标拷贝数为A，未经提取直接检测内标物的拷贝数为B，两倍的A比上B为提取效率用C标记，即校正标准物的系数：C％＝2×A/B×100％。