[发明专利]一种用于微滴式核酸绝对定量标定的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于微滴式核酸绝对定量标定的试剂盒及应用。

背景技术

标准物质(reference material,RM)是具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准设备、评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。核酸标准物质是指用于核酸扩增技术的标准物质，属于生物标准物质的一种。由于核酸不能单独应用物理和/或化学的方法进行准确描述，因此必须应用生物学反应来补充描述其特性，所以迄今为止传统意义的一级参考测量程序(物理和化学方法)和一级参考物质在核酸扩增技术检测中还没有。

在核酸标准品领域，英国国家生物制品检定所作为WHO指定的国际标准品实验室，是目前全世界最主要的国际标准品和参考品生产者和分发者，生产超过95％的国际标准品。WHO于1997年发布了首个用于核酸扩增技术的核酸标准物质———丙型肝炎核酸(RNA)国际标准物质，随后陆续发布了乙型肝炎核酸、人类免疫缺陷病毒－1型核酸等16种不同病毒核酸的标准物质。WHO发布的一系列核酸标准物质是目前最为广泛应用于分子检测方法校正和定量的标准物质。WHO制备的核酸标准物质的定值采用通过国际多家权威实验室合作来进行定值，使当前不同实验室、不同检测方法得出的检测结果的表述单位统一使用国际单位(IU)表示。

目前，中国在核酸标准物质的研制方面才刚刚起步。2005年，中国卫生部临床检验中心研制的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸血清标准品、丙型肝炎病毒核糖核酸血清标准品被国家质检总局批准为国家二级标准品。这是中国在核酸检测领域首次引入国际标准，对中国肝炎病毒核酸定量检测系统的标准化及检验结果的准确性和可比性起到了极大的推动作用。中国兽医药品监察所作为中国兽用标准物质研制、供应的唯一法定单位，目前尚无核酸标准物质提供。

在核酸标准物质的定量上，由于技术条件的限制目前的国际单位通常只代表PCR的最低检测限单位或等量基因组，无法精确定量到目的基因拷贝数。随着近年来数字PCR技术的发展，使得绝对定量成为可能，数字PCR技术将会越来越多的应用于核酸标准物质的研究和定量。

数字化PCR(Digital PCR，dPCR)的概念早在1999年就由Bert Vogelstein采用并发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品(如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的核心理念——“无限稀释”(terminal dilution)。Bio-Rad公司的QX200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量PCR的一个test变成20,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)。QX200 ddPCR系统包括两台仪器：微滴发生器和微滴分析仪，及其相关的耗材。微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。随后微滴转移至96孔PCR板上，开展终点PCR扩增。采用微滴分析仪(droplet reader)逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。与传统的定量PCR相比，数字PCR的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字PCR技术，研究人员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。

核酸标定通用版试剂盒中内标基因的寻找：由于内标的组成一般是一段150bp的寡核苷酸的序列。用于监控提取的效率，矫正检测数据。用于内标的序列必须是和所有物种的序列都不匹配，不会干扰正常的实验，所以其寻找的工作量巨大，而且不一定能获得。在150bp长度的序列上设计引物探针用于绝对定量的检测也是很难攻克的问题。

目前绝对定量的检测试剂是封闭的，试剂的检测效率不是最佳的，例如有2000copies浓度的原样，只能检测出1500copies，需要优化试剂提高检出率。绝对定量的关键技术微分化技术由于试剂原因也受限，由于绝对定量最后是用泊松分布统计学建模得出绝对定量的数据，泊松分布统计学建模是通过总微分化的数量和阳性微单位的数量得出相应的系数，从而给出绝对定量的数值，所以最后微分化的量是影响结果的关键。