[发明专利]一种微流体装置及基于微流体装置的单细胞核酸适体单轮筛选方法

说明书

本发明公开了一种快速获取核酸适体的微流体装置，它包括微流体通道，所述微流体通道设有输入口和输出口，所述微流体通道内腔底部设有若干个用于分配单个细胞的微室。本发明还公开了基于上述微流体装置的单细胞核酸适体单轮筛选方法，该方法能高效获得特异性识别靶细胞的核酸适体。

技术领域

本发明涉及一种微流体装置及基于微流体装置的单细胞核酸适体单轮筛选方法。

背景技术

核酸适体是上世纪90年代发展起来的，是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)从含大量寡聚核苷酸的核酸文库中筛选得到能高亲和性高特异性识别靶标的DNA/RNA分子。核酸适体具有可与抗体相媲美的识别功能，目前已成为化学与生物医学研究的重要工具。传统的核酸适体筛选技术只能针对纯物质(如提纯的蛋白质)来进行筛选，难以实现对细胞和复杂生命体系的有效识别。这是因为：1)许多疾病标志物尚未发现；2)可作为标志物的膜蛋白难以纯化；3)纯化后的蛋白与活细胞生理环境中蛋白的构象存在差异，导致纯蛋白为靶标的核酸适体不能识别细胞。我们课题组针对这一难题，提出了针对活细胞这一复杂体系进行核酸适体筛选的新概念，创建了以疾病相关阳性细胞为靶细胞、以阴性细胞为参比的细胞筛选法。细胞筛选方法的发展，解决了如何在标志物未知的情况下获得研究细胞及其它复杂生命体系所必需的分子探针的关键科学问题，为病变细胞膜蛋白标志物的高效发现和鉴定提供了基础。该方法先后被国际上40多个实验室采用，得到了同行的普遍认可，已广泛用于白血病、肺癌、肝癌、胰腺癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤的研究，推动了分子诊疗学的发展。

细胞筛选法能产生区分正常细胞和疾病细胞之间的分子差异的核酸适体。但是细胞筛选法还存在以下一些缺陷：筛选周期长，通常需要12轮以上的筛选才能获取结合靶细胞的进化核酸文库；筛选效率较低，最终产生的进化核酸文库往往含有大量不能结合靶细胞的核酸序列，阻碍了核酸适体的发现；筛选需要大量细胞，不能针对稀有细胞样品进行筛选；筛选成本较高。这些缺陷严重制约了细胞筛选法在不同实验室和临床上的应用。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种微流体装置及基于微流体装置的单细胞核酸适体单轮筛选方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述微流体装置包括微流体通道(1)，所述微流体通道(1)设有输入口(2)和输出口(3)，所述微流体通道(1)内腔底部设有若干个用于分配单个细胞的微室(4)。

其中，所述微流体通道(1)呈U型折流布置。

所述微流体通道(1)的长、宽、高均为20±0.5微米，优选为20微米；所述微室(4)的直径为20±0.5微米，优选为20微米；微室(4)的深度为20±0.5微米，优选为20微米；彼此相邻的微室(4)之间的间距为2200—2400微米，优选为2300微米。

基于上述微流体装置的单细胞核酸适体单轮筛选方法包括如下步骤：

(1)将靶细胞样品注射进入微流体装置，控制流体速度为50-100微升/分钟，使细胞分散于微流体装置的微室中；

(2)将设计和合成的核酸适体文库与参比细胞孵育，然后离心，弃去与参比细胞结合的核酸适体，将未与参比细胞结合的核酸适体注射进入微流体装置，控制流速为50-100微升/分钟，使核酸适体与微室中的靶细胞结合；

(3)将洗涤缓冲液注射进入微流体装置，通过改变洗涤时间和洗涤缓冲液流速来控制筛选压力，收集洗脱液，将洗脱液中的核酸适体即为筛选后所得的核酸适体；其中，改变洗涤时间的范围为3-10分钟，控制洗涤缓冲液的流速为50-100微升/分钟。

优选地，设计和合成的核酸适体文库序列如SEQ ID NO.1所示，筛选后所得的核酸适体的序列如SEQ ID NO.2，和SEQ ID NO.3所示。设计和合成的核酸适体文库序列如SEQID NO.4所示，筛选后所得的核酸适体序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。