[发明专利]一种检测JAK2V617F基因突变的引物组合物及其试剂盒和检测方法在审

专利信息
申请号: 201711002034.4 申请日: 2017-10-24
公开(公告)号: CN107841536A 公开(公告)日: 2018-03-27
发明(设计)人: 关明;曹国君;许笑;唐宜桂;张心菊;康志华;邓萱;马玮哲;王俨;马艳春 申请(专利权)人: 复旦大学附属华山医院
主分类号: C12Q1/6844 分类号: C12Q1/6844;C12Q1/6886;C12N15/11
代理公司: 上海申新律师事务所31272 代理人: 竺路玲
地址: 200040 上*** 国省代码: 上海;31
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摘要:
搜索关键词: 一种 检测 jak2v617f 基因突变 引物 组合 及其 试剂盒 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及分子生物学领域,尤其涉及一种检测JAK2 V617F基因突变的引物组合物及其试剂盒和检测方法。

背景技术

经典的骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasm,MPN)是一组以一系或多系成熟血细胞扩增为特征的克隆性疾病,包括真性红细胞增多症(polycythemia vera,PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia,ET)和原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis,PMF),可造成严重贫血、急性白血病转化等,血栓是最常见的并发症,也是MPN患者的主要致死原因。

PV是一种克隆性的以红细胞异常增殖为主的慢性骨髓增生性疾病,患者表现为红细胞大量增殖,影响氧的运输,血清促红细胞生成素水平低于正常下限,骨髓活检显示增生活跃,易合并出血及血栓性并发症和脾肿大。ET患者表现为持续性的血小板升高(>450×109/L),巨核细胞增生,脾肿大,容易发生血栓或出血。PMF是以骨髓中巨核细胞和粒细胞显著增生伴反应性纤维化,巨核细胞发育异常为特征,近20%的患者最后演变为急性白血病,死因多为严重贫血、充血性心力衰竭、出血或反复感染、急性白血病转化等。此三类疾病之间可互相转化或合并存在,由于患者血细胞过度增殖而引起血液淤滞,从而可诱发各种心脑血管疾病。

PV、PMF和ET的常规诊断主要根据临床表现、实验室检查和病理形态学分析进行综合判断。由于反应性增生与MPN同样具有外周血细胞计数增加的实验室检查特征,加之MPN的临床症状不典型,对于不同类型的MPN与反应性增生之间的鉴别诊断一直是困扰临床的问题。在过去的近半个世纪,有关经典的骨髓增殖性肿瘤研究发展缓慢,几乎是一个被血液学界遗忘的角落,自2005年JAK2 V617F突变被发现以来,特别是近年随着二代测序技术在临床的推广应用,MPN特异性的基因突变谱系得以被揭示,为经典的骨髓增殖性肿瘤的诊断、预后和治疗策略制定提供了全新的分子标志物[5]。

2005年,国际上多个研究小组几乎同时发现了在MPN患者的骨髓和外周血中存在JAK2 V617F点突变,此突变是位于JAK2基因14外显子1849位碱基G>T点突变,通过将617号密码子的缬氨酸置换为苯丙氨酸影响JH2结构域的活性,并导致JAK2自主抑制功能失调,在没有细胞因子刺激的条件下使JAK2仍能被激活并促进造血细胞增殖。

JAK2V617F在MPN的突变率分别为:PV 95%,ET 50%~60%,PMF 50%~60%,但至今尚无在淋巴细胞疾病、实体肿瘤和反应性骨髓增殖性病变中出现JAK2 V617F突变的报道,因此现认为JAK2 V617F突变的发现对MPN的诊断是革命性的突破。JAK2 V617F突变发现一年之后,在该突变阴性的ET和PMF患者中发现了骨髓增生性白血病病毒致癌基因(MPL)突变,但PV患者未发现有此突变。MPL基因位于染色体1p34,编码血小板生成素受体并影响巨核细胞的增殖及分化。MPL突变是位于MPL基因10号外显子515位密码子色氨酸TGG置换为亮氨酸TTG(515L)或色氨酸TGG替换为赖氨酸AAG(515K)。约5%~10%的ET/PMF患者携带MPL突变,MPL 515突变已经成为ET和PMF分子标志物。

目前,JAK2 V617F、MPL W515K/L突变已被WHO纳入了此类疾病的主要诊断标准,这些分子标志物的发现不仅有助于MPN的诊断和鉴别诊断,还有助于判断临床转归和预后。如JAK2 V617F突变负荷越高,患者年龄越大,血红蛋白水平和白细胞计数则越高,血小板计数越低,脾大和皮肤瘙痒也越明显。随着JAK2 V617F突变负荷增高,PV和ET患者发生血栓和继发ET、PV后的骨髓纤维化的概率也显著增高。近年来,越来越多的分子标志物,如MPL、TET和CALR突变等相继被发现,这些标志物的发现对于理解MPN的分子发病机制具有重要意义,也有助于对这类疾病的患者进行诊断和治疗。

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