[发明专利]一种纤维素酶的制备方法

权利要求书

1.一种纤维素酶的制备方法，包括选用里氏木霉制备所述的低温中性纤维素酶，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，活化菌种；培养活化后的菌种，挑取单菌落制备孢子悬浮液，并用紫外照射孢子悬浮液，诱变得到孢子菌落；

(2)将(1)中的孢子菌落涂布于初筛培养基中，在10～15℃下培养3～5天，挑选初筛菌株并纯化该菌株；

(3)在10～15℃下，将(2)中的纯化菌株按5％的接种量接种于发酵培养基中，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为48～72小时；

(4)将(3)中的种子液按发酵液体积3～5％的接种量接种于产酶培养基中，10～15℃培养96～144小时，即里氏木霉发酵生产低温中性纤维素酶结束；将发酵液在4000～6000rpm离心，收集所得液体为粗酶液；

(5)将(4)得到的粗酶液进行超浓缩过滤，得到1000～2000UI/G的浓缩酶液；

其特征在于：步骤(4)中的扩大种子液的制备步骤为：

a.培养至发酵液OD600到达0.8-1.0；

b.流加培养，优选的，流加培养时发酵液的OD600为0.8-1.0；或取出部分发酵种子液，以获得枯草芽孢杆菌B3发酵种子液，向保留的种子液中补加无菌发酵培养基，并继续发酵培养至发酵液OD600到达0.8-1.0，

c.枯草芽孢杆菌B3发酵种子液。

2.根据权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征在于：所述初筛培养基选用60.0～80.0g马铃薯，0.5gK2HPO4，2.0～2.4g明胶，20.0～25.0g琼脂和1.0L蒸馏水制备，并将制备好的所述初筛培养基在温度为115℃～121℃的高压蒸汽下灭菌30分钟。

3.根据权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基选用3.0～5.0g玉米粉，0.5～1.0g蛋白胨，0.8～1.2g(NH4)2SO4，1.2～1.8gKH2PO4，0.1～0.3g尿素，0.1～0.2gCaCl2和1.0L蒸馏水制备，并将制备好的所述发酵培养基在温度为115℃～121℃的高压蒸汽下灭菌30分钟。

4.根据权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征在于：所述产酶培养基选用70.0～80.0g麸皮，15.0～20.0g米糠，0.15～0.2g羧甲基纤维素，0.05～0.1g(NH4)2SO4，0.05～0.1gMgSO4，0.1～0.15gK2HPO4和1.48～1.52L蒸馏水制备，并将制备好的所述产酶培养基在温度为115℃～121℃的高压蒸汽下灭菌30分钟。

5.一种采用如权利要求1～4中任一项所述的的制备方法获得的低温中性纤维素酶的复配方法，其特征在于：所述浓缩酶液与表面活性物质、防腐剂、稳定剂中的一种或多种组分进行复配，其质量百分比分别为：浓缩酶液10～50％，表面活性物质5～10％，防腐剂0.1～1％，稳定剂1～30％，其它：去离子水，即复配成低温中性纤维素酶制剂。

6.根据权利要求5所述的纤维素酶的复配方法，其特征在于：所述表面活性物质由脂肪醇聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯聚氧丙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧丙烯醚以及烷基酚聚氧乙烯醚中的一种或几种物料组成；所述防腐剂由布罗波尔、戊二醛、卡松以及苯氧乙醇中的一种或几种物料组成；所述稳定剂由氯化钠、氯化钙、氯化镁、甘油、山梨醇、丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸钠以及聚乙烯醇中的一种或几种物料组成。