[发明专利]一种纤维素酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种纤维素酶的制备方法。

背景技术

纤维素酶(cellulase)是一种重要的酶产品，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，能降解纤维素β-1，4糖苷键生成纤维二糖和葡萄糖等小分子物质的一组酶的总称，是一种复合的诱导酶，包括多种水解酶。纤维素酶的工业化应用主要集中在生物能源，酿造工业，洗涤工业，造纸工业及纺织工业等行业中。在生物能源方面，纤维素酶将纤维素物质彻底的分解，其水解产物变成单糖，再将其进一步发酵，便可产生生物柴油；在酿造工业中，可用于啤酒的生产，增加发酵糖的产量，也可用于酱油的酿造，增加酱油的产量以及改善其质量；在洗涤工业中，纤维素酶加到洗涤剂中，能将水合纤维素分子彻底破坏，彻底清除封闭在纤维内部的污渍，提升洗涤效果；在造纸工业中，纤维素酶能使纤维表面改性，减少机械打浆的能耗；在纺织工业中，用于棉麻的后整理，纤维素酶能降低反应温度，使反应条件温和，织物整理平滑触感好。

现有技术中发酵种子液的扩大生产很难，发酵菌株在培养过程中，容易发生退化，不能连续进行发酵培养获得发酵种子液，目前生产中还没有一种具有良好稳定性的菌株，以达到连续化豆粕发酵，在豆粕发酵过程中，发酵菌株的退化问题是影响豆粕发酵连续化的一个重要问题。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种纤维素酶的制备方法，解决了纤维素酶制备程中，发酵种子液中菌落发生退化的问题。

为实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：一种纤维素酶的制备方法，包括选用里氏木霉制备所述的低温中性纤维素酶，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，活化菌种；培养活化后的菌种，挑取单菌落制备孢子悬浮液，并用紫外照射孢子悬浮液，诱变得到孢子菌落；

(2)将(1)中的孢子菌落涂布于初筛培养基中，在10～15℃下培养3～5天，挑选初筛菌株并纯化该菌株；

(3)在10～15℃下，将(2)中的纯化菌株按5％的接种量接种于发酵培养基中，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为48～72小时；

(4)将(3)中的种子液按发酵液体积3～5％的接种量接种于产酶培养基中，10～15℃培养96～144小时，即里氏木霉发酵生产低温中性纤维素酶结束；将发酵液在4000～6000rpm 离心，收集所得液体为粗酶液；

(5)将(4)得到的粗酶液进行超浓缩过滤，得到1000～2000UI/G的浓缩酶液；

所述(4)中的扩大种子液的制备步骤为：

a.培养至发酵液OD600到达0.8-1.0；

b.流加培养，优选的，流加培养时发酵液的OD600为0.8-1.0；或取出部分发酵种子液，以获得枯草芽孢杆菌B3发酵种子液，向保留的种子液中补加无菌发酵培养基，并继续发酵培养至发酵液OD600到达0.8-1.0，

c.枯草芽孢杆菌B3发酵种子液。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：提高生产效率和设备利用率；减少设备投入及能耗、降低生产成本；提高了发酵种子液中成活性。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的说明。

一种纤维素酶的制备方法，包括选用里氏木霉制备所述的低温中性纤维素酶，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，活化菌种；培养活化后的菌种，挑取单菌落制备孢子悬浮液，并用紫外照射孢子悬浮液，诱变得到孢子菌落；

(2)将(1)中的孢子菌落涂布于初筛培养基中，在10～15℃下培养3～5天，挑选初筛菌株并纯化该菌株；

(3)在10～15℃下，将(2)中的纯化菌株按5％的接种量接种于发酵培养基中，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为48～72小时；

(4)将(3)中的种子液按发酵液体积3～5％的接种量接种于产酶培养基中，10～15℃培养96～144小时，即里氏木霉发酵生产低温中性纤维素酶结束；将发酵液在4000～6000rpm 离心，收集所得液体为粗酶液；

(5)将(4)得到的粗酶液进行超浓缩过滤，得到1000～2000UI/G的浓缩酶液；

步骤(4)中的扩大种子液的制备步骤为：

a.培养至发酵液OD600到达0.8-1.0；