[发明专利]一种用于PCR快速检测猪圆环病毒3型的试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于快速检测猪圆环病毒3型的检测试剂盒和方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)成员。猪圆环病毒颗粒为二十面体对称、无囊膜包裹的、单股环状DNA病毒。病毒粒子直径为17nm，是目前发现的最小的动物病毒。2016年之前猪圆环病毒根据致病性、抗原性和核酸序列的差异，将PCV分为PCV1和PCV2。PCV1于1974年由德国学者Tischer首次在连续传代的PK-15细胞培养物中作为一种污染物被发现，发现其对猪没有致病性。PCV2于1998年首次报道，发现其是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原体。1997年在加拿大西部发现PMWS以后，在世界上许多国家和地区都有该病的报道。该病主要发生在5～12周龄仔猪，患病动物表现为渐进性消瘦、皮肤苍白、淋巴结肿大、偶有黄疸等病理症状。在中国，该病是由郎洪武等首次发现的。除此之外，PCV2也能够引起猪皮炎肾病综合征(PNDS)、母猪繁殖障碍、猪呼吸道综合征及仔猪先天性震颤等多种猪圆环相关疾病(PCVAD)。近年来，以PCV2为主要病原引起的猪圆环病毒病在世界范围内广泛流行，该病毒主要侵害猪的免疫系统，并能够造成机体的免疫抑制，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。

2016年，在美国北卡罗莱纳州的一个商品化猪场，猪场工作人员发现母猪死亡率增加了10.2％，受孕率降低了0.6％。猪场中一部分母猪表现厌食，皮肤呈现多灶性丘疹，斑点和表面皮炎，这些临床症状与传统的猪圆环病毒病引起的临床症状一致，但对所有母猪和胎儿组织进行免疫组化和荧光定量PCR检测都未检测到对PCV2、高致病性蓝耳病病毒、甲型流感病毒、猪细小病毒等。随后研究人员进行病毒分离，检测到一种新型的圆环病毒3型(PCV3)。该病毒基因组长为2000bp，其能引起猪的皮炎肾病终合症、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。近期，华中农业大学何启盖教授组在我国首次报到新型猪圆环病毒PCV3的分离鉴定。

目前猪圆环病毒3型为一种新发的猪传染病的病原菌，其能引起猪的皮炎肾病综合症、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，该病原菌对猪场疾病控制十分重要，这需要对我国PCV3感染情况进行全面的调查。由于我国新发现的猪圆环病毒3型与美国的猪圆环病毒3型有差异，所以目前尚无针对该病原菌的有效检测措施，而现有的检测方法采用在血清样品中检测抗PCV3衣壳抗体的酶联免疫吸附测定，其检测方法检测时间长，灵敏度低，易出现假阴性。因此急需建立一种可以准确检测PCV3病毒的敏感、特异、重复性好的检测方法，这对该病毒的监控以及之后的控制和预防尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一组用于PCR快速检测猪圆环病毒3型的核酸，本发明的另一个目的在于提供一组用于PCR快速检测猪圆环病毒3型的试剂盒。本发明的再一个目的是提供一种用于PCR快速检测猪圆环病毒3型的方法。该检测方法具有快速准确灵敏，特异性强，重复性好，且操作简单成本低，可以同时进行大批量样本检测分析，适用于临床样本的检测。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一组用于PCR快速检测猪圆环病毒3型的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。

一种用于PCR快速检测猪圆环病毒3型的检测试剂盒，其含有如上所述的引物。

如上所述的试剂盒，优选地，该试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种：PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照。

如上所述的试剂盒，优选地，所述阳性对照为含有SEQ ID No.3所示序列的质粒载体，所述阴性对照为无核酸酶水。

一种用于PCR快速检测猪圆环病毒3型的方法，该方法是非诊断目的的检测方法，其采用上述的引物或试剂盒对待检样品进行PCR扩增，并检测扩增产物。具体包括以下步骤：

(1)准备检测样本的DNA；

(2)对步骤(1)所述DNA进行PCR扩增；其中，在反应体系中，采采用上下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

(3)对所述步骤(2)的扩增产物进行电泳；

(4)结果判定：样品出现345bp扩增条带为猪圆环病毒3型检测阳性，否则为阴性。