[发明专利]一种细胞内胆固醇敏感度和定位的测量方法及其诊断试剂

权利要求书

1.一种胆固醇敏感度的测量方法，其特征在于：包括LDL标准品的制备、细胞培养方法、RNA提取方法以及一步法荧光定量RT-PCR四大步骤；

其中，LDL标准品的制备具体步骤如下：

(一)、取健康自愿者血浆，加入抗氧化剂；

(二)、10000g以下离心30min，去除乳糜微粒；

(三)、然后加溴化钠将血浆以密度调整为1.006kg/L，40000r/min超速离心18h，吸出上层乳白色液体及次层淡黄色液体，收集下层液体；

(四)、再加入溴化钠(NaBr)调整其终密度为1.063gkg/L，再次40000r/min超速离心24h，吸出上层橙黄色液体即获LDL；

其中，细胞培养方法具体步骤如下：

(一)、将分离健康人和疾病人群的PBMC，小部分细胞直接用于检测PBMC内胆固醇敏感器SCAP的表达水平；

(二)、大部分细胞用含10％的无脂血清的RPMI1640培养基，种在12孔板中，培养12小时；

(三)、然后与用上述方法制备的不同浓度的LDL胆固醇，浓度分别为0、25、50、100、200μl/ml，共孵育24小时，然后按照下列方法提取mRNA；

其中，RNA提取方法为采用Trizol来提取PBMC的RNA，然后分离RNA；

其中，一步法荧光定量RT-PCR，采用一步法完成反转录和PCR两个过程，不必再取出cDNA；

试剂包括经过优化的缓冲液、RT-PCR MIX，dNTP、Sybr green I染料和MgCl2溶液混合物，并拟使用定量荧光PCR检测PBMC的SCAP的表达水平，以及不同浓度LDL刺激下LDLr和HMGCoAR的mRNA水平,并计算50％LDLr和HMGCoAR被抑制时LDL胆固醇的浓度，反映细胞/机体对胆固醇的敏感度，根据不同浓度LDL状态下，LDLr和HMGCoAR mRNA的水平，计算出IC50。

2.如权利要求1所述的胆固醇敏感度的测量方法，其特征在于：所述抗氧化剂为100umol/L EDTA、20umol/L丁羟甲苯。

3.一种胆固醇敏感度的测量的检测试剂盒，其特征在于：其中包括权利要求1的几部分的试剂，定量荧光RT-PCR试剂可适合任意荧光定量PCR仪。

4.一种验证胆固醇敏感度IC50的准确性的方法，其特征在于：

(一)、U937细胞用含10％的无脂血清的RPMI1640培养基，种在12孔板中，培养12小时，与用上述方法制备的不同浓度的LDL胆固醇共孵育24小时，然后用Trizol提取细胞总RNA，一步法荧光定量RT-PCR，根据不同浓度LDL状态下，LDLr和HMGCoAR mRNA的水平，并用Excel软件作出量效关系曲线，拟和线性回归方程计算mRNA IC50；

(二)、用基因转染的方法，在CHO细胞上建立不同表达水平SCAP超表达的细胞系，转染了不同浓度的SCAP的CHO细胞，用含10％的无脂血清的RPMI1640培养基，种在12孔板中，培养12小时，然后用Trizol提取细胞总RNA，使用定量荧光PCR检测SCAP的表达水平，与PBMC内胆固醇敏感器SCAP的表达水平比较，用此细胞作为阳性对照来检查试剂盒对PBMC内SCAP定量检测的上述方法的准确性和灵敏性，并根据检测结果对各种实验条件及生产工艺进行调整，使试剂盒的准确性和灵敏度达到技术要求的标准。

5.一种细胞内胆固醇的定位检测方法，其特征在于：新鲜分离的PBMC细胞并涂片并固定、游离胆固醇和内质网特异的荧光双探针孵育，标记、细胞内萤光定量和校正四大步骤；

其中，新鲜分离的PBMC细胞并涂片，具体步骤如下：

(一)、将分离健康人和疾病人群的PBMC，并用离心涂片机涂片；

(二)、细胞用3％多聚甲醛固定；

其中，游离胆固醇和内质网特异的荧光双探针孵育，标记，具体步骤如下：

用胆固醇染料或者胆固醇敏感器(蛋白或特异肽)和内质网特异的荧光双探针孵育，标记；

其中，细胞内萤光定量和校正四大步骤，具体步骤如下：

用荧光显微镜观测细胞器内游离胆固醇的含量并用Sigma Scan Pro software对荧光进行定量，并用细胞总面积来校正结果。

6.一种细胞内胆固醇的定位检测试剂盒，其特征在于：其中包括权利要求1的几部分的试剂。

7.一种细胞内胆固醇的定位检测的准确性的方法，其特征在于：

(一)为了评估此方法的正确性，还将选用密度梯度超高速离心法分离内质网并直接测量内质网和线粒体胆固醇的方法来佐证双荧光探针法的准确性；

(二)临床评估：人群选择参照第一部分，我们将用双荧光探针标记法细胞内胆固醇定位快速诊断试剂测量正常人群和疾病人群PBMC内胆固醇的含量，建立正常健康人群PBMC内胆固醇含量的基线；并探讨其与血胆固醇水平、动脉硬化之间的相关性。