[发明专利]一种鉴别中国沿岸鲬鱼未定种sp与刀鲬的分子标记引物及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种鉴别中国沿岸鲬鱼未定种sp与刀鲬的分子标记引物及方法。

背景技术

鲬鱼未定种sp，隶属于鮋形目、鲬亚目、鲬科、鲬属，中国境内目前仅在南海沿岸有分布。其外部形态与刀鲬极为相似：背鳍鳍条II-VII-I+13；臀鳍鳍条13；胸鳍鳍条18-20(主要18或19)；腹鳍鳍条I,5；尾鳍分叉鳍条9-12(主要12)。侧线鳞67-76；体较短，平扁，向后渐尖细。吻平扁，略長。口大，上位，向后延伸超过眼睛前缘。眼小，眼后无凹陷。间鳃盖骨不具附肢。眼下稜光滑，仅1棘。前鳃盖骨上方具2棘，下棘长于上棘。虹膜垂简单型(simple)。眼眶前具1棘或無。眼眶上方具1棘。侧线鳞具单一开口。尾鳍具有3-5条黑色横带。鲬鱼未定种sp同刀鲬一样，皆为近岸重要的经济鱼种。其肉质细腻鲜美，具有很高的食用价值。目前用于鉴定鲬鱼未定种sp的方法还没有见正式报道。由于二者形态非常相似，仅凭借形态特征很难将两者区分。因此寻找区分鲬鱼未定种sp和刀鲬的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个亟待解决的问题。这将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够准确高效地中国沿岸鲬鱼未定种sp与刀鲬，引物长度适当，与模板的序列紧密互补，鉴别方法简单，易于掌握，准确性高，鉴定结果稳定，可重复性强的鉴别中国沿岸鲬鱼未定种sp与刀鲬的分子标记、引物及方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种鉴别中国沿岸鲬鱼未定种sp与刀鲬的分子标记引物，引物序列为：

Fish F1:5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’；

Fish R2:5’-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’。上述引物长度适当，与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低，其自身不存在互补序列，自身难以形成发夹结构，与模板的序列能够紧密互补，且延伸温度小于74℃，有利于扩增反应的进行。

本发明还提供一种鉴别中国沿岸鲬鱼未定种sp与刀鲬的分子标记方法，具体步骤如下：提取鲬鱼未定种sp与刀鲬的DNA，以两种鱼的DNA为模板进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果。该步骤依赖于酶促反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性—低温退火—引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。

优选的，PCR扩增的反应体系组成为：超纯水17.5ul、10×buffer 2.5ul、dNTPs 2ul、rTaq 0.15ul、模板1ul、Primer各1ul。

优选的，PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存∞。该条件下，靶序列变性彻底，其不影响rTaq酶的活性，引物延伸完全，能够达到有效的扩增量，且非特异性扩增少，所得的分子标记序列稳定一致。

优选的，中国沿岸鲬鱼未定种sp的分子标记序列为：