[发明专利]一种基于毛细管电泳技术鉴定易成花荔枝种质资源的方法

说明书

技术领域

本发明属于荔枝遗传育种技术领域，具体涉及一种基于毛细管电泳技术鉴定易成花荔枝种质资源的方法。

背景技术

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)为无患子科荔枝属植物，起源于中国，因果实形、色、香、味俱佳和营养丰富而誉称“岭南果王”驰名中外。以往生产经验表明低温是荔枝完成成花诱导所需的关键外界环境因子，还发现极少数的荔枝品种(如“三月红”、“褐毛荔”)仅需要较短时间的低温就能够完成成花诱导，容易成花，因而称为易成花荔枝品种；而大多数的荔枝品种(如“桂味”、“糯米糍”、“紫良喜”)必须经过整个冬天的低温才能完成成花诱导，难成花，因而称为难成花荔枝品种。研究调查发现易成花荔枝品种主要起源于我国荔枝产区的北方地区(如云南等地)，而难成花荔枝品种主要起源于荔枝产区的南方地区(如海南等地)。以往生产经验还表明：冬天低温不足是荔枝不能稳定成花的主要原因，特别对于难成花荔枝品种来说更是如此。

在荔枝生产中，每年由于成花不稳定所造成的产量没保障是广大果农长期以来面临的一个主要难题。其中一个主要原因在于难成花荔枝品种所占比例过高，而易成花荔枝品种所占比例偏少，荔枝产量受冬天低温不足影响很大。造成以上现象的一个主要原因在于缺乏对易成花荔枝品种的分子鉴定，另一个主要原因在于可满足商品性栽培的优质易成花荔枝品种稀少。目前虽有少数的易成花荔枝品种(如“三月红”)，但由于其品质差而被逐渐淘汰掉。难成花荔枝品种(如“桂味”和“糯米糍”)，虽然成花受冬天低温不足影响很大，但是由于其高品质而受到广大消费者的亲睐，逐渐得到大面积推广，可是每年的产量得不到保障，如2017年由于受冬天低温不足的影响(暖冬)，产量减产80％左右。因此，对易成花荔枝品种的分子鉴定以及优质易成花荔枝品种的选育尤为重要。

发明人通过人工设施栽培在夏季对荔枝开展反季节低温诱导实验，有力证明了低温是诱导荔枝成花的关键环境因子，对荔枝的叶片和顶芽开展局部低温诱导实验，证明了荔枝的叶片是感受低温诱导信号的关键器官，为此发明人对低温处理的叶片开展RNA-Seq和小RNA高通量深度测序。其中通过 RNA-Seq筛选到一个荔枝成花关键基因LcFT1，进一步研究证明低温是通过诱导荔枝叶片中LcFT1基因的表达进而导致其成花。进一步研究发现荔枝 LcFT1基因存在两个类型，即低温敏感型和低温不敏感型，这主要是由两者启动子碱基序列的差异造成，还发现含有低温敏感型LcFT1基因的荔枝容易成花，即LcFT1基因为纯合低温敏感型或为杂合型的荔枝容易成花。主要原因在于低温敏感型LcFT1基因对低温非常敏感，很少的低温量就能诱导其表达即使在暖冬的年份，进而导致荔枝很容易成花(相关结果以Promoter difference of LcFT1is a leading cause of natural variation of flowering timing in different litchi cultivars(Litchi chinensis Sonn.)发表在plant science,2015, 241:128-137)。以上研究结果也与以往生产经验相符，如易成花荔枝品种(如“三月红”、“褐毛荔”、“妃子笑”、“兰竹”、“桂早荔”等)都是含有低温敏感型 LcFT1基因的荔枝，它们只需要冬天较短时间的低温就能够完成成花诱导，因而易成花。而难成花荔枝品种(如“马贵荔”、“桂味”、“糯米糍”、“紫良喜”等)都是LcFT1基因纯合低温不敏感型荔枝，它们必须经过整个冬天的低温才能够完成成花诱导，需低温量多，因而难成花。发明人根据两个类型LcFT1 基因启动子的差异开发一对引物LcCeED-F和LcCeED-R，并基于毛细管电泳技术鉴定易成花荔枝种质资源。

毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)是20世纪80年代问世的一种高效液相分离法，是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物，被认为是当代分析科学最具活力的前沿研究课题。毛细管电泳技术因其分离效率高、分析速度快、样品用量少、易于自动化等特点而广泛应用于分子生物学、医学、药学、高分子等领域，尤其在生物分析及生命科学相关研究中显示广阔的应用前景。本发明为今后优质易成花荔枝品种的选育和推广打下一定的基础，具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明首次根据荔枝两个类型LcFT1基因的差异开发一种基于毛细管电泳技术鉴定易成花荔枝种质资源的方法。

本发明目的之一是提供上述方法的发明理论基础。

本发明目的之二是提供上述方法的具体发明内容。

本发明目的之三是提供上述方法的具体检测步骤。