[发明专利]一种检测番茄早疫病菌的环介导等温扩增引物及应用

说明书

本发明提供了一种检测番茄早疫病菌的环介导等温扩增引物及其应用，所述的引物由F3、B3、FIP和BIP4条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑4所示。本发明解决了现有技术中番茄早疫病菌的检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差及PCR检测技术需要热循环仪器等昂贵设备的问题，本发明的检测体系在LAMP扩增条件下，能快速、高效、高特异、高灵敏地检测到番茄早疫病菌，适宜病原菌和病害的现场检测，易于大范围推广应用，为防治番茄早疫病提供可靠的技术和理论依据。

技术领域

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及番茄早疫病菌的环介导等温扩增（LAMP）检测引物及其应用，可用于番茄早疫病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于番茄早疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

背景技术

番茄（Solanum lycopersicum L.）为茄果类蔬菜，营养丰富，是人们普遍喜爱的一种蔬菜，具有较高的食用价值，加之适应性较强，全国各地普遍栽培，深受消费者欢迎，经济效益显著。随着保护地种植和设施农业技术的发展，番茄种植实现了周年供应生产，但在生产中也存在了一些问题，其中病虫害是影响番茄生产可持续发展的重要因素之一。

由茄链格孢菌（Alternaria solani）侵染引起的番茄早疫病是番茄生产上的主要病害之一，也是一种世界性病害，在美国、澳大利亚、以色列、印度、希腊等地发病率都很高，严重时可使产量损失35%-78%，80年代以来在我国黑龙江、吉林、山东、河北、山西、广东、湖北、江苏和福建等大部分地区也普遍发生，危害日趋严重，一般年份发病率在10%左右，造成产量损失10%-30%，流行年份发病率可达100%，产量损失可达30%-40%，甚至绝收，成为露地、保护地番茄生产中的重要病害。番茄早疫病菌主要以菌丝和分生孢子随病株残体在土壤中越冬，气候条件适宜时，产生新的分生孢子是初侵染的来源，病斑上的分生孢子主要靠风雨等传播，通过气孔或伤口侵入，在条件适宜时，病菌侵入寄主后只需2-3天就可形成病斑，再经过3-4天即可产生大量的分生孢子，引起多次重复侵染。该病可以引起落叶、落花、落果和断技，对产量影响很大，严重时可以使产量损失50%以上，随着番茄早疫病的出现及其日益严重，因此，很有必要建立一套快速灵敏的检测方法用于番茄早疫病的早期诊断，防止其从发病区向未发病区传播，对番茄早疫病的及时控制具有重要意义。

目前检测番茄早疫病菌的方法很多，主要以传统方法和分子生物学方法为主，即分离培养、致病性测定、症状观察等及先进的分子生物学技术包括DNA探针、PCR技术及血清免疫学检测等，传统检测方法在一定程度上发挥了重要作用，但该方法费时，一般情况下需要5～7天，有时达到10～15天，很难满足快速鉴定的需要；核酸探针杂交技术虽然特异、灵敏，但步骤繁琐；聚合酶联式反应(polymerase chain reaction，PCR) 和实时荧光定量PCR(real-time PCR) 技术虽然灵敏、快速，但是两种方法要求实验室有PCR仪器或荧光定量PCR设备，且对操作人员素质要求高，且PCR扩增后需通过电泳步骤获得结果也是一个繁杂的问题，在基层的农业部门难以大规模推广应用。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型的核酸扩增技术。扩增反应在恒温下进行(60-65℃)，是一种特异、高效、快速的扩增DNA的技术。由于LAMP的扩增效率非常高，扩增反应结果可以通过荧光染料染色后肉眼观察；扩增反应可产生大量的焦磷酸镁而使反应呈现浑浊，在LAMP扩增结束后无须电泳可直接肉眼观察反应是否有浑浊现象来判断，且不需要昂贵的PCR仪，可广泛应用于病原的基层检测。目前尚未见应用LAMP技术用于检测番茄早疫病菌的相关技术报道。

发明内容