[发明专利]一种快速检测茶树炭疽病菌的LAMP引物及检测方法

权利要求书

1. 一种快速检测茶树炭疽病菌的LAMP引物，其特征在于，所述的引物为外引物F3、B3和内引物FIP、BIP，其引物的核酸序列分别为：F3: 5’- CCGTCAATCATCGACCTCCT-3’，B3:5’- TCTCGTCACGTACCAGAAGG -3’，FIP: 5’- CTTACGCACTGGCCGGTCTG-GGAATGTTTTGCTGACTGCG-3’，BIP: 5’- CCGAGTCAAATCCAACCGCCT-GCACCAATCTGGTTACCCTG-3’。

2.一种LAMP法检测茶树炭疽病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组DNA：采用CTAB法或用市售的DNA提取试剂盒，按操作步骤提取待测样品中DNA；

（2）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的外引物F3、B3和内引物FIP、BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，在200 μLPCR管中加入下列试剂：5 μM外引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；

（3）LAMP反应条件：将配制好反应体系的PCR管于63℃水浴锅中恒温反应60 min，然后80℃下反应5 min 终止反应；

（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，静置5min进行显色观察，在常光下观察到绿色荧光的判断为阳性，存在茶树炭疽病菌，橙色或橘黄色判断为阴性，不存在茶树炭疽病菌，在紫外光下若观察到浑浊状沉淀则判断为阳性，存在茶树炭疽病菌，澄清透明则判断为阴性，不存在茶树炭疽病菌。

3. 根据权利要求2所述的一种LAMP法检测茶树炭疽病菌的方法，其特征在于，LAMP反应混合液由以下组分组成：40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100。

4.如权利要求1所述的引物在茶树炭疽病的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。