[发明专利]用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，特别的，涉及一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

EGFR表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表达产物，定位于细胞膜上。目前已经报道不下30种EGFR基因突变与药物反应性有关，但绝大部分是外显子19上的缺失突变。通过对患者EGFR基因的突变检测，可辅助临床医生筛选可受益于分子靶向抗肿瘤药物如易瑞沙、特罗凯和凯美纳等的肿瘤患者。

临床上大都采用病理组织标本提取DNA进行EGFR检测，但晚期肺癌病人有时无法获取肿瘤标本。血液(血浆)肿瘤基因突变检测方便在不同时间点获取样本，没有空间抽样偏差，已逐渐在临床上推广应用。近年来的研究还表明，癌症病人的血浆中能否检测到癌细胞逸出的突变DNA，以及分析血浆中肿瘤基因含量的变化，可以为肿瘤的疗效监测及预后提供重要的参考。

采用血浆检测EGFR基因突变检测的是来源于肿瘤组织的体细胞突变，不同于检测一般性的遗传突变；在血浆中存在大量野生型DNA。传统的测序法要求突变含量达到20％以上才能有效检出，因此不适合用于血浆EGFR基因突变检测。

《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》已于2015年发布，推荐采用突变基因特异扩增PCR法(ARMS法)用于血浆EGFR基因突变检测。研究表明，19外显子缺失型中以2种E746-A750del突变型(2235_2249del15和2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的70％左右，其它缺失型出现频率都较低。由于外显子19上存在大量缺失类型，而ARMS法要求对每种突变类型都设计特异性引物，不能对未知突变类型进行检测。目前商品化的ARMS法EGFR检测试剂盒最多只能检测19种19外显子缺失型。

肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)由丹麦科学家在1991年最先先成。PNA是具有类多肽骨架的DNA类似物，主链骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA/DNA杂交的TM值比DNA/DNA高15℃，但PNA与DNA若有单碱基错配，则结合能力很弱或不结合。PNA钳制PCR检测基因突变的原理是：通过设计一条涵盖突变位点的15-25bp长的PNA，其序列与野生型序列完全匹配，当PCR的模板为野生型时，PNA与其完全匹配，引物延伸受阻，扩增可受到强烈地抑制；而当PCR的模板为突变型时，PNA与其存在哪怕是一个碱基的错配，两者间的杂交能力急剧下降或完全消失，引物延伸不受影响，扩增可以正常进行。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法，针对EGFR基因的19号外显子区域，在缺失突变位置两端的保守区域设计一对PCR引物，在PCR上游引物3’端附近的保守区域设计一条探针；在缺失突变位置设计一条与EGFR野生型基因完全匹配的PNA序列，基于PNA钳制PCR检测基因突变的原理对肿瘤组织标本或血液(血浆)中提取的DNA进行检测，具有检测速度快、检测类型多及灵敏度高的优点。具体地：

本发明提供一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组，所述引物组包括扩增引物对、探针及PNA，其中：

所述扩增引物对序列如下：

正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；

反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；

所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；

所述PNA序列为：

NH₂-5’-GATGTTGCTTCTCTTAATTCC-3’-COOH。

本发明同时提供一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒，所述试剂盒包括两套PCR反应体系，第一套PCR反应体系包括针对EGFR基因19外显子野生型和缺失突变检测设计的扩增引物对及探针，其中：

所述扩增引物对序列如下：

正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；

反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；

所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；

所述第一套PCR反应体系还包括2×PCRbuffer、DNA模板和去离子水；