[发明专利]一种提取板蓝根干样基因组DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于DNA提取技术领域，涉及板蓝根基因组DNA的提取方式。

背景技术

板蓝根为十字花科二年生草本植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根，是传统的名贵中药材之一，具有清热、解毒、凉血消肿、利咽之功效，是我国近年来治疗感冒的常用药材。目前市售南板蓝根常见混有球花马蓝、少花马蓝等伪劣品，且部分地区出现误用或混用马鞭草科路边青等现象，严重影响了板蓝根的临床应用及其中成药的质量。

随着分子生物学的快速发展，利用基因组DNA检测药物的真伪已进入实际应用，高效地提取药用植物基因组DNA可以有效降低该方法的应用成本。植物板蓝根干样中含多糖、蛋白质、多酚或其它不易去除的杂质，目前使用的CTAB(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide)法大多针对提取板蓝根鲜样，而针对市售的板蓝根干样，目前的方法提取的基因组DNA得率低，成功率低且所得DNA质量较差，严重影响了 PCR 反应及分子鉴定等后续的工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取板蓝根干样基因组DNA的方法，以解决现有技术提取板蓝根干样基因组DNA效果不佳的问题。

本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明所述的一种提取板蓝根干样基因组DNA的方法，其步骤如下。

（1）取去除表皮的板蓝根干样组织0.05~0.1 g，使用液氮在研钵中研磨成粉末，在组织解冻前转移到1.5mL离心管中。

（2）加入500~750 μL的 2%的CTAB(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide)溶液，颠倒混匀后在65℃水浴2~3 h，期间要上下颠倒混匀数次。

（3）取出离心管，加入与步骤（2）等体积的按24:1体积比混合的三氯甲烷与异戊醇的混合液，上下颠倒充分混合，晃动数次。

（4）4℃条件下14000 rpm 离心15min。

（5）用移液枪吸取管中上层水相。

（6）在抽提出的水相中加入与等体积4℃下预冷的异丙醇，轻轻晃动混匀后在-20 ℃沉淀6~12小时。

（7）4℃条件下14000 rpm 离心15min，去上清，倒置于吸水纸上控干。

（8）加入与步骤（2）等体积的无水乙醇，上下颠倒数次，洗涤沉淀，4℃条件下12000 rpm离心10min离心，去上清，倒置于吸水纸上控干。

（9）重复步骤（8）两遍。

（10）将步骤（9）所得沉淀置于超净工作台中吹干。

（11）在离心管中加入30~50 μL的灭菌去离子水或者TE缓冲液(Tris-EDTA buffer solution)，4℃放置4~6小时。

（12）-20℃或-80℃低温保存。

采用本发明的方法提取干样板蓝根组织基因组DNA，其所用试剂易得，成功率高且所得DNA质量较好，有利于PCR反应及分子鉴定等后续的工作。

具体实施方式

本发明将通过以下实施例作进一步说明。

实施例1。

（1）称取去除表皮的板蓝根干样组织0.1g，迅速使用液氮在研钵中将其研磨成粉末，在组织解冻前转移到1.5mL离心管中。

（2）加750 μL 的2% CTAB，颠倒混匀后在65℃水浴3 h，期间要上下颠倒混匀数次。

（3）取出离心管，加入等体积的24:1 （三氯甲烷：异戊醇）混合液，上下颠倒充分混合，晃动5 min。

（4）4℃条件下14000 rpm 离心15min，将离心管动作轻缓的取出转子，放置于离心架上。

（5）用移液枪吸取管中上层水相。

（6）在抽提出的水相中加入等体积4℃预冷的异丙醇，轻轻晃动混匀后在-20℃沉淀6小时。

（7）在4℃条件下14000 rpm离心15 min，去上清，倒置于吸水纸上控干。

（8）加入适量700 μL 70%酒精，上下颠倒数次，4℃条件下12000 rpm离心10min，倒置于吸水纸上控干。

（9）重复步骤（8）两遍。

（10）将步骤（9）所得沉淀置于超净工作台中吹干。

（11）在离心管中加入50 μL的灭菌去离子水或者TE缓冲液，4 ℃放置4小时。

（12）-80℃低温保存。

实施例2。