[发明专利]一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗蛋白的基因序列如序列表SEQ ID No.1所示，该VP35蛋白亚单位疫苗免疫草鱼鱼体后，通过刺激鱼体免疫细胞增殖、诱导鱼体抗病毒基因上调表达以及刺激鱼体特异性抗体产生以提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力，进而用于预防水产养殖中因草鱼呼肠孤病毒引起的草鱼出血病，其中鱼体免疫细胞为单核细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞，所述鱼体抗病毒基因为IFNI、MHC I、IgM和TLR22。

2.一种权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。

3.一种权利要求1或2所述的草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于具体步骤为：

（1）质粒VP35-pET32a的构建：以草鱼呼肠孤病毒的双链RNA基因为模板，通过反转录获得cDNA，用引物F1和R1进行PCR扩增，产物纯化后用Kpn I和Hind III双酶切，回收1kp片段，同时将质粒pET32a(+)用Kpn I和Hind III双酶切，回收5.8kb片段，将上述回收的两个DNA片段用T₄ DNA连接酶连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）后在含氨苄青霉素的LB固体培养基培养，筛选含有VP35-pET32a的阳性菌液，所述引物F1为：5’-TCGGGTACCATGGAACCAGCAAAACC-3’，引物R1为：5’-ATAAGCTTGGT ACTGTCCC TGGATCTCAGG-3’；

（2）疫苗蛋白的诱导表达和纯化：将含有VP35-pET32a的阳性菌液在含氨苄的LB液体培养基上于37℃培养过夜活化，按体积比1:100将培养液转接到新鲜的含氨苄LB液体培养基上，于37℃培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度1mM IPTG，继续培养6小时，离心收集菌体并用结合缓冲液悬浮，超声波破碎1小时，离心收集沉淀，并溶解在含6M脲的结合缓冲液中，冰上过夜，将溶解上清用Ni-IDA琼脂糖凝胶柱收集回收并透析，最终得到由序列表SEQ ID No.1的基因序列编码的亚单位疫苗蛋白。