[发明专利]一种草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗蛋白由草鱼呼肠孤病毒S7基因节段编码，该草鱼呼肠孤病毒S7基因节段的碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白即为草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗蛋白，该亚单位疫苗蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；

将该亚单位疫苗按照2µg疫苗蛋白/g鱼体重量注射草鱼腹腔后，通过激发草鱼免疫细胞的增殖提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力，草鱼免疫细胞为淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞；

将该亚单位疫苗按照2µg疫苗蛋白/g鱼体重量注射草鱼腹腔后，通过诱导草鱼抗病毒基因的表达有效提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力，草鱼抗病毒基因为IgM、IFN I、MHC I和TLR22；

将该亚单位疫苗按照2mg疫苗蛋白/g鱼体重量注射草鱼腹腔后，通过诱导鱼体产生特异性抗体有效提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力，进而用于预防水产养殖中因草鱼呼肠孤病毒感染而引起的草鱼出血病。

2.一种权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于具体步骤为：

（1）质粒pET32a-VP56的构建，以分离的草鱼呼肠孤病毒的基因组为模板，反转录后用引物S7F1/S7R1进行PCR扩增，产物纯化后用Kpn I和Xho I双酶切，回收1kb片段，同时将质粒pET32a(+)用Kpn I和Xho I双酶切，回收5.8kb片段，将上述回收的两个DNA片段用T₄ DNA连接酶连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）后在含氨苄的LB固体培养基上培养，筛选含有质粒pET32a-VP56的阳性重组菌；

（2）疫苗蛋白的诱导表达和纯化：将含有质粒pET32a-VP56的阳性重组菌在含氨苄的LB液体培养基中于37℃培养过夜，按体积比1:100将培养液转接到新鲜的含氨苄LB培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养6小时，离心收集菌体并用结合缓冲液悬浮，超声波破碎1小时，离心收集沉淀并溶解在含6M尿素的结合缓冲液中，冰上过夜，将溶解上清用Ni-IDA琼脂糖凝胶柱收集回收并透析复性即可获得由序列表SEQ IDNo.1所示碱基序列编码的亚单位疫苗蛋白。