[发明专利]一种草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于基因工程及分子免疫学技术领域。本发明的技术方案要点为：一种草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗，该亚单位疫苗蛋白由草鱼呼肠孤病毒S7基因节段编码，该草鱼呼肠孤病毒S7基因节段的碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白即为草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗蛋白，该亚单位疫苗蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。本发明的亚单位疫苗蛋白注射草鱼鱼体后能够显著刺激鱼体免疫细胞增殖、抗病毒相关基因上调表达以及特异性抗体大量产生，有效提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力，进而用于预防水产养殖中因病毒引起的草鱼出血病。

技术领域

本发明属于基因工程及分子免疫学技术领域，具体涉及一种草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）主要感染一龄以内草鱼鱼苗，引起草鱼出血病，主要发病症状为体表及鳍条末端发黑，腹部肿大，突眼，下颌、鳍基充血，口腔、肌肉、内脏有明显出血。草鱼出血病发病季节长，每年6月下旬至9月底是主要的流行季节，8、9月为发病高峰季节，在水温25-30℃最为流行。我国草鱼养殖主要病害有草鱼出血病、肠炎病、赤皮病、烂鳃病和“肝胆综合症”等，其中以草鱼出血病危害最为严重，其发病快、流行广、死亡率高，一旦爆发流行，苗种最高死亡率可达90%，给我国草鱼养殖产业造成重大损害。

通过疫苗免疫草鱼一直以来是预防和控制草鱼出血病的重要方法，研究人员起初采用病鱼的内脏组织研磨成匀浆，然后灭活用来作为疫苗免疫健康草鱼，但是这种方式免疫效果差，而且容易引起鱼体局部或全身反应。随后用细胞培养的病毒，灭活后接种鱼体获得了较好的免疫效果。草鱼呼肠孤病毒在细胞中连续传代后，其毒力会减弱，利用这一原理制备的减毒活疫苗，免疫保护效果良好，但是这种疫苗存在病毒复壮的风险。

近些年来，对于草鱼呼肠孤病毒亚单位疫苗的研究也有所开展，将病毒的外衣壳蛋白基因VP5插入到表达载体中，构建的原核表达亚单位疫苗可以达到50%以上的免疫保护率；将病毒的VP6基因插入到昆虫杆状病毒中构建的病毒载体疫苗可以刺激鱼体产生抗病毒免疫。但是现有的亚单位疫苗种类仍然较少，不足以应对病毒变异导致的疫苗失效的风险，而且越来越多的新型草鱼呼肠孤病毒株被发现和分离，这些新型的草鱼呼肠孤病毒称为II型草鱼呼肠孤病毒，以区别于最早发现的I型草鱼呼肠孤病毒。新型病毒株致病性更强，流行范围更广，而目前针对II型草鱼呼肠孤病毒的疫苗种类数量极少。因此针对新型病毒，寻找草鱼呼肠孤病毒新的抗原位点，应用新的靶标蛋白来制备亚单位疫苗就尤为重要。采用生物信息学的方法分析发现，新型草鱼呼肠孤病毒S7基因节段编码的VP56蛋白结构非常特殊，具有和腺病毒的纤维突起蛋白（fiber protein）相似的结构，因此称之为类纤突蛋白，已知腺病毒是依靠其衣壳上的纤突蛋白首先与细胞接触，然后入侵细胞，在病毒入侵的过程中起至关重要的作用，并且纤突蛋白具有良好的免疫原性，利用纤突蛋白制备的抗体能够中和腺病毒，使其失去感染能力。基于以上研究，本发明将草鱼呼肠孤病毒的类纤突蛋白VP56制备成了亚单位疫苗并免疫注射鱼体，显示该亚单位疫苗能够有效刺激鱼体产生抗病毒抗体，进而提高鱼体的免疫力和抗病毒感染的能力。

目前，未见利用草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白制备亚单位疫苗的相关报道。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种草鱼呼肠孤病毒类纤突VP56蛋白亚单位疫苗及其制备方法，该亚单位疫苗通过诱导鱼体产生特异性抗体有效提高草鱼抗草鱼呼肠孤病毒感染的能力，进而用于预防水产养殖中因草鱼呼肠孤病毒感染而引起的草鱼出血病。