[发明专利]一种3D全层皮肤模型及用于其形成的培养基、制备方法

说明书

本发明公开了一种3D全层皮肤模型及用于其形成的培养基、制备方法。该培养基包括蛋白制剂，所述蛋白制剂包括0.1～99％白蛋白、0.1～99％球蛋白以及0.1～99％纤连蛋白，所述百分比为质量百分比。利用该培养基结合猪I型胶原制备3D全层皮肤模型的气液相过程无需使用血清，并降低了生产成本；制备得到的3D全层皮肤模型完整，且活性和稳定性都有显著提高，拓展了该类型模型的应用领域，使得皮肤模型的大规模产业化生产得以实现。

技术领域

本发明涉及皮肤组织工程学领域。具体涉及一种3D全层皮肤模型及用于其形成的培养基、制备方法。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，它是外界环境与内部器官之间的重要屏障，可以防止身体水分的流失、环境影响、伤害或感染等，而且有助于调节身体体温。由于其暴露于外界，容易受到如机械、热或化学损伤的影响，虽然皮肤屏障通常能自我修复，但多种因素如感染，氧化或伤口面积过大会导致皮肤屏障难以修复。临床治疗中通常会选择接种皮肤，但其受到健康供体可用部位的限制，如可用部位面积有限，因此开发了许多皮肤替代物，如人工合成膜和异体皮肤替代物等，但其在嫁接点的存活时间有限，只可提供短时间的生理性创面封闭，使其应用具有很大的局限性。针对这些局限性，近些年利用皮肤工程学进行研究并开发了人体皮肤模型，并广泛应用于研究伤口愈合，皮肤癌和皮肤生物学等领域。由于皮肤模型具有屏障功能，使其成为替代皮肤进行相关测试的重要组成部分。随着欧盟规定不再允许出售动物实验的消费品，应用皮肤组织工程构建皮肤模型模拟天然皮肤，代替动物进行相关安全性测试已成为一种趋势。此外皮肤模型在其它不同的行业领域也有广泛应用，如在制药领域，通常使用皮肤模型研究药物的作用机理和发病机制。在化妆品领域可用来筛选活性物或评估化妆品原料的功效性和安全性。基于此，需要开发具有模拟天然皮肤层的结构的人造皮肤。

迄今开发的用于制备人工培养的皮肤模型的代表性方法的实例包括在去表皮的真皮上制备重建表皮的方法，其中人角质化细胞在去除表皮的真皮上三维培养。具体为包括(1)分别培养成纤维细胞和表皮细胞(人角质化细胞)；(2)培养成纤维细胞构建真皮层；(3)采用人角质化细胞构建表皮层；(4)全层皮肤的培养，通常为气液相培养(CN104726396A)。其中，真皮层的构建作为角质化细胞生长的基础，其根本在于材料的选择。

目前在真皮层的构建中会用到高分子合成原料，如纯的高分子聚乳酸(PLA),聚乙醇酸(PGA)，聚氨酯等或天然原料。由于天然材料是自然界中原本真实存在的，其组成和结构都更近似于真实的皮肤组织，因而被更广泛应用于皮肤模型构建中。在天然原料的使用方面，又主要存在两种技术：第一种为应用材料学和生物工程学技术，将壳聚糖、胶原、硫酸软骨素等生物材料交联形成多孔的材料，用于作为真皮替代物。如第三军医大学，王旭等用人I型，III型胶原，6-硫酸软骨素进行戊二醛交联形成真皮支架物，中国专利CN1310027A(使用人I型，III型胶原，6-硫酸软骨素进行交联)。但是这类技术存在以下缺陷：(1)稳定性差，由于天然原料不可避免的批次性差异性，导致成品的可控性差，形成的多孔原料孔径差异大；(2)制备技术要求高，合成技术复杂，无法大规模生产。(3)成本较高。第二种为直接使用胶原构建真皮层。国内最早开展的是，伍津津等用鼠尾胶原和Fb制成细胞凝胶其上接种KC；第四军医大学金岩等使用牛I型胶原凝胶的人工皮肤(Active Skin)；同时也有专利WO9116，010，使用高纯度的无孔胶原层，胶原为I型，III型牛胶原；专利CN106573087A使用天然或去端肽的鼠胶原以及一些研究使用人I型，III型胶原。但是使用牛，人，鼠的胶原存在以下缺陷：(1)人的胶原虽最接近人体皮肤，但来源有限。(2)鼠的胶原，产量少不容易量产。(3)牛胶原虽取材相对广泛，但有传播病毒的可能。因此选择易于取材、成本低且品质控制性强的胶原对于皮肤模型的制备意义重大。