[发明专利]一种用于植物材料梯度脱水的石蜡切片方法

说明书

本发明公开了一种用于植物材料梯度脱水的石蜡切片方法，包括样品的采集及固定、样品的脱水、样品的透明、浸蜡、包埋、修块、固定、切片、展片、干燥、脱蜡、封固等步骤。本发明的样品材料经二甲苯透明后，虽然植物体中的叶绿素会完全降解，但植物细胞的细胞壁和细胞核被番红染成红色，而使植物样品呈现红色，经二甲苯透明后，样品的颜色与包埋的石蜡的颜色极易区分，在包埋样品时很容易包埋成需要的样品方向，并且在修块时可以很清楚地看清材料在包埋块中的位置，使修块、切片、展片和镜检操作非常简便，能够避免误伤材料，在镜检时很方便检测到材料的展开程度，进而提高了切片质量和实验效率。

技术领域

本发明涉及植物学技术领域，尤其涉及一种用于植物材料梯度脱水的石蜡切片方法。

背景技术

石蜡切片是组织学、发育生物学研究的主要实验方法，同时也是病理学中观察病理变化的重要手段，为科研和临床诊断做出了卓越贡献。该技术应用石蜡与动植物的组织能够很好地结合这一基本原理，经过标本采集、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、摊片、贴片、烘片、脱蜡、染色、脱水、透明等一系列特殊的方法制成透明的薄片，在显微镜或电子显微镜下观察，可如实地反映机体的结构和形态变化；定量地测定样品中组织结构的大小、数量及所含物质的量的多少；同时，还可观察机体镜下结构或所含物质在不同实验条件下的变化，由此了解组织细胞的活动、分化以及细胞间的相互关系等。石蜡切片的制作过程并不复杂，但影响切片质量和效率方面的因素是多方面的，要制出高质量的切片，每一个操作步骤都至关重要。

石蜡切片包埋前的处理过程异常重要，包埋前的流程包括标本采集、固定、脱水、透明、浸蜡流程，过程看似简单，但这决定石蜡切片后期包埋、修块、切片、摊片、贴片、展片的效率，乃至成败。

实践中标本采集后，经FAA、卡诺试剂、多聚甲醛等固定液固定一定时间后进行梯度酒精脱水(30％、50％、70％、85％、90％、100％、100％)、1/2酒精与1/2二甲苯过度、纯二甲苯透明两次，植物样品经固定、梯度酒精脱水，植物体中的叶绿素会完全降解，而使植物样品呈现土黄色或淡黄色，再加上经二甲苯透明后，其样品尤其是花、叶及鲜嫩的茎或根的颜色常常和包埋的石蜡的颜色难以区分。在包埋样品时，一方面因样品颜色和石蜡颜色相似难以包埋成需要的样品方向；另一方面，即使样品包埋的方向和截面位置和方向正确，在修块时往往看不清材料在包埋块中的位置而难以修块；此外即使顺利切成完好的蜡带，在展片时，也会因材料颜色和石蜡相似，镜检困难，不能很好的使蜡带很好的展开，或者展片过度，样品展裂，进而降低切片质量或使得切片破坏，降低实验的效率。

目前石蜡切片制作技术中，往往通过在脱水过程中的70％酒精中加入适量番红对材料进行染色。然而，在脱水过程中的70％酒精中加入适量番红对材料进行染色后，虽然后期的包埋、切片及展片过程中切片的效率得到了提高，但一方面植物样品经70％酒精的番红溶液脱水后，酒精浓度会大大降低，无法再次在脱水染色中使用，因此溶有番红的酒精最终仍会被扔掉，导致染料的浪费，同时造成环境的污染等问题。另一方面，在的70％酒精(含翻红染料)中的脱水过程往往时间过长，导致植物样品染色过深，进而可能影响后期的某些免疫定位实验效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种用于植物材料梯度脱水的石蜡切片方法，使石蜡切片材料脱水过程中的染料可重复利用、染料浪费少、不会造成环境的污染，且整块植物样品染色深度易控，后期的免疫定位实验效果好。

一种用于植物材料梯度脱水的石蜡切片方法，包括以下具体步骤：

1)样品的采集及固定：采集新鲜材料浸入固定液中，真空抽气15～20min，然后于固定液中固定24～36h，保证固定液充分浸泡材料，使固定液迅速杀死细胞，防止细胞自溶，保存完整的细胞结构；

2)样品的脱水：将固定后的材料依次通过质量分数为30％、50％、70％、85％、90％、100％、100％的梯度乙醇溶液进行脱水，每个梯度的乙醇溶液中分别脱水0.2～2h；脱水时间应视组织种类、组织块大小、厚薄和固定剂的不同而异。