[发明专利]一种在单分子水平同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种在单分子水平同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用，该传感器基于修饰有8‑羟基鸟嘌呤且尾端标记花菁3(Cy3)和猝灭基团的分子信标以及修饰有脱氧次黄嘌呤且尾端标记花菁5(Cy5)和猝灭基团的两种不同的分子信标用于检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶和N‑甲基嘌呤DNA糖基化酶，与受动力学和热力学影响严重的传统分子信标不同，Cy3和Cy5的信号恢复取决于DNA糖基化酶为媒介的分子信标劈裂，该方法在不涉及任何信号扩增的情况下能够实现同时灵敏检测对hOGG1和hAAG活性的超灵敏检测，操作简便、快速，试验结果准确、可靠。

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及基于一种在单分子水平同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用。

背景技术

DNA糖基化酶是一种碱基切除修复路径中的初始酶，此种酶能够识别并切除变异的DNA碱基并产生无嘌呤或者无嘧啶(AP)位点，DNA糖基化酶的正常活动保证了碱基切除修复的稳定性从而保证基因组的稳定性。碱基切除修复路径至少涉及11种不同的哺乳动物糖基化酶，这些酶通过依赖不同的变异类型发生作用。此外，异常的DNA糖基化酶和癌症，神经病，心血管疾病和炎症等一系列疾病密切相关。

检测糖基化酶的传统方法包括放射性标记法，酶连免疫吸附测定，高相液相色谱法，以磁珠纳米颗粒为基础的分离法，以金纳米颗粒为基础的比色法。放射性标记法将待检测物标记一种或两种放射性核素从而用于检测。酶连免疫吸附测定(ELISA)基于酶分子与抗体或者抗抗体分子的共价结合，通过ELISA 检测仪进行测定从而判断有无相应的反应。高相液相色谱法(HPLC)以液体为流动相，向色谱柱内加入不同的洗脱液从而在柱内将各种成分分离，进入检测器进行检测。磁珠纳米颗粒为基础的分离法以修饰DNA为发卡探针连接磁珠与荧光基团实现荧光猝灭，通过糖基化酶引发的发卡探针劈裂并分离磁珠实现荧光基团的释放从而获得信号。以纳米金颗粒为基础的比色法通过使分散状态的纳米金颗粒团聚，使纳米金溶液的颜色发生改变，并通过紫外分光光度计检测纳米金溶液在520nm和650nm波长处的紫外吸收峰。

然而这些传统的检测方法需要昂贵的标记试剂，所需DNA片段过于冗长，检测设备过于昂贵，这些均增加了实验成本并且上述方法步骤繁琐，分析时间长，特异性及灵敏度较差。

为了提高检测灵敏度，人们在糖基化酶检测中引入了一些扩增步骤，如核酸外切酶(λ核酸外切酶或核酸外切酶III)辅助的信号扩增，目标介导的自动催化生成DNA核酶的滚环扩增和低变性温度聚合酶链反应扩增。这些方法通过扩增进行信号放大提高了检测灵敏度，但外切酶辅助的信号扩增对反应体系要求较高，重现性差。而目标介导的自动催化生成DNA核酶的滚环扩增易发生非特异性扩增，产生假阳性信号，降低特异性。同时低变性温度聚合酶链反应依赖高精度的温度循环，多种引物和特定的DNA聚合酶，增加检测的复杂性和花费。此外，上述这些扩增放大信号的方法仅仅能够用于测量一种DNA 糖基化酶。因此开发一种简单灵敏廉价且能够同时检测多种DNA糖基化酶的方法成为本领域研究人员亟待解决的问题。

发明内容

针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供一种同时检测8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)和N-甲基嘌呤DNA糖基化酶 (hAAG)的荧光化学传感器，该传感器基于修饰有8-羟基鸟嘌呤且尾端标记花菁 3(Cy3)和猝灭基团的分子信标以及修饰有脱氧次黄嘌呤且尾端标记花菁5(Cy5) 和猝灭基团的两种不同的分子信标用于检测hOGG1和hAAG，与受动力学和热力学影响严重的传统分子信标不同，Cy3和Cy5的信号恢复取决于DNA糖基化酶为媒介的分子信标劈裂，该方法在不涉及任何信号扩增的情况下能够实现同时灵敏检测对hOGG1和hAAG活性的超灵敏检测，操作简便、快速，试验结果准确、可靠。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器包括：hOGG1分子信标和hAAG分子信标；