[发明专利]一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别涉及一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法及试剂盒。

背景技术

叶酸代谢与人体内许多的生化过程密切相关。一方面作为体内生化反应中碳单位转移酶系的辅酶，起着碳单位传递体的作用，另一方面参与DNA和RNA的合成、蛋白质的甲基化，此外也直接影响氨基酸的代谢。参与到叶酸代谢途径的酶有多种，包括二甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、甲硫氨酸还原酶(MTR)、甲硫氨酸合成还原酶(MTRR)和胱硫脒β合酶(CBS)等，这些酶的某些核苷酸多态可导致叶酸代谢异常引起疾病或出生缺陷。

二甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）第677位碱基C>T变异(rs1801133)，可导致MTHFR蛋白第222位的丙氨酸被缬氨酸取代，杂合变异型(677CT)和纯合变异型(677TT)，在中国人群中的百分比分别为44％和23％，TT基因型人群高同型半胱氨酸（Hcy）水平显著升高，大量流行病和临床研究都证实TT基因型和高Hcy是脑卒中发生的独立危险因素。MTHFR第1298位碱基A>C变异(rs1801131)，可使MTHFR蛋白第433位的谷氨酰胺被丙氨酸取代，杂合变异型(1298AC) 和纯合变异型(1298CC)，在中国人群中的百分比分别为29.3％和3.9％，杂合突变型和纯合突变型相比野生型，MTHFR酶活性酶活性有所下降，甚至只能达到野生型的酶活性的30%左右，导致血清叶酸和维生素B12水平下降，血浆中同型半胱氨酸水平升高。甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶，是叶酸代谢的关键酶之一。主要变异型有十余种，其中A66G是最主要和研究最多的突变。MTRR基因第66位碱基A>G变异(rs1801394)，导致MTRR蛋白氨基酸链残基22位蛋氨酸被异亮氨酸替代，引起酶的活性降低，导致同型半胱氨酸血症，增加神经管畸形和先天性心脏病等出生缺陷性疾病的发病风险。其中杂合变异型(66AG)和纯合变异型(66GG)在中国人群中占36％和6％。

叶酸是细胞生长和组织修复所必需的物质，在胚胎发育过程中，对孕妇尤其重要。据我国婚前育龄女性血清抽样调查发现，我国城市和农村女性缺乏叶酸者分别有21％和38％。据卫生部及疾控中心相关报告，我国每年有90万新生儿缺陷性疾病诞生，患出生缺陷排在前5位的包括：先天性心脏病，神经管畸形，唇腭裂，唐氏综合征，多指(趾)，这些都与孕妇叶酸缺乏有一定关系。1997年卫生部开始推荐孕期女性统一补充叶酸，剂量为400微克/天，该措施在出生缺陷预防中起了重要作用。但由于孕妇对叶酸的代谢能力不足，出生缺陷的发生率仍存在很大的地域差异。对于叶酸代谢能力正常的孕妇来说，每天补充400微克叶酸是足够的，但是对叶酸代谢能力存在障碍的孕妇来说，应该增加补充剂量，对所有成年人包括孕妇和乳母，合成叶酸制剂的可耐受的最高摄入量(UL)设定为1000微克/天。因此800微克/天的叶酸制剂是安全的。对叶酸的增补剂量并非越多越好。大量研究发现，过量补充叶酸会导致以下不良后果：导致体内锌缺乏，孕母叶酸过量补充会导致胎儿生长缓慢，出生体重过低。近年来的研究表明，叶酸代谢能力在个体间的差异与部分基因位点的多态性有关，具体位点包括：亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的c.677位点、c.1298位点；甲硫氨酸合成还原酶(MTRR)基因的c.66位点；因此，利用基因分型技术检测孕母叶酸代谢相关基因型，对受检者叶酸利用能力进行分级，进而针对性的调整叶酸补充剂量。

当前市场上检测基因多态性的方法很多，包括如基因芯片法，基因测序，限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphisms, RFLP）等，其中基因测序为突变检测的金标准，但因其所需时间长，费用高，对取材要求严格，限制了在临床中的使用。RFLP仅适用于突变位点附近存在适当的特定限制性内切酶识别序列的情况，应用局限性较大。因此，对于患者而言，快速拿到检测结果尤为重要，所以本专利发明了一种基于实时荧光PCR方法，检测成本很低，从样本提取到结果分析，整个过程可在1小时之内完成，有望在临床上开展普筛叶酸代谢相关基因检测成为可能。

发明内容

为了解决叶酸代谢多态性的检测，本发明提供一种叶酸代谢基因多态性位点的基因型检测方法及试剂盒。