[发明专利]一种分离鸡胚生殖嵴来源的原始生殖干细胞方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的分离和培养鸡胚生殖嵴来源的原始生殖干细胞方法。

背景技术

原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)是各级生殖细胞和成熟配子的始祖细胞，生殖细胞是精子和卵细胞的前体细胞。在胚胎和个体发育的过程中，PGCs经过不断分裂和分化演变成精子和卵细胞。PGCs是一类具有发育多潜能性的细胞，在干细胞研究，转基因动物和嵌合体生产和发育生物学研究中具有重要作用。目前国内外对鸡PGCs分离的方法已有大量报道。目前主要有生殖新月分离(5-8HH)，胚胎血液分离(12-19HH)和生殖腺分离(28HH)，分离方法也会影响PGCs的分离效果。韩毅冰等人通过分离孵化至48-55小时鸡胚(5-8HH)血液，分离获得了PGCs；李赞东等人从第12-17期鸡胚血液中使用了Ficoll密度梯度离心、滤膜和MiniMACS三种方法分离了PGCs，比较了三种方法的效果；秦洁等探索通过Ficoll密度梯度离心和胰酶消化法分别在胚胎血液分离(12-19HH)和生殖腺分离(28HH)的PGCs分离效果。大量的研究表明，胚胎血液分离(12-19HH)和生殖腺分离(28HH)应用较为广泛，且能够获得PGCs用于下一步研究，但是发现血液分离的PGCs数量较少，而生殖腺分离的PGCs含有大量其他来源的细胞，纯化较为复杂。此外，PGCs的体外培养环境要求复杂的细胞培养体系，保证其具备无限增殖的能力和未分化的状态，不同实验室采取不同的分离方法和体系，由于PGCs的多能性维持机制尚不明确，且各种方法操作复杂，重复性差，限制了PGCs的进一步应用，需要进一步的优化和改进。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术缺点，提供了一种新的分离鸡胚生殖嵴来源的原始生殖干细胞方法，提取简便快速，旨在从早期生殖嵴(21-24HH)中分离大量纯净且全能性高的PGCs，为PGCs的应用奠定基础。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种新的分离鸡胚生殖嵴来源的原始生殖干细胞方法，包括以下步骤：

(1)无菌取出21-24HH早期胚胎，使用PBS浸洗3次；

(2)在解剖显微镜下去头尾，剥离出生殖嵴，获取早期生殖嵴组织，使用PBS浸洗3次；

(3)加入预热(37℃)的胰蛋白酶进行消化，室温消化5mins，消化时轻轻吹打使生殖嵴组织分散；

(4)加入含有小牛血清的培养基终止消化，100目网筛过滤后300转离心5mins，弃上清后使用PGCs培养基进行重悬，重悬后进行差速贴壁培养，培养45mins后吸上清，连续差速贴壁培养3次后即可得到纯度较高的PGCs。

优选的，所述生殖嵴部位为早期胚胎后肠前1/3的背外侧组织部位。

优选的，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.25％，胰蛋白酶的加入体积为1-2ml。

优选的，所述含有小牛血清的培养基的质量浓度为5％，含有小牛血清的培养基的体积为1-2ml。

优选的，所述胰蛋白酶的预热温度为37℃。

本发明的优越性在于：

1.本发明中的PGCs来源于刚刚由血液迁入生殖嵴，比在生殖嵴完全定居后的PGCs具有更高的增殖活力和多能性。

2.本发明中取得的PGCs与血液来源PGCs相比，血细胞等干扰较少，且操作简单，重复性好，对工具和器材设备的要求较低，具有广泛的推广前景。

3.本发明采用共培养方法，无需特意构建饲养层，在培养基中添加细胞因子和其他营养成分，能够维持PGCs的未分化状态和增殖能力。

4.本发明可以快速简便的获得大量具有多能性且增殖能力强的PGCs，可以用于进一步的实验研究，为PGCs在建系培养，转基因鸡制备和嵌合体研究等方面的推广应用奠定良好基础。

附图说明

图1早期胚胎(21-24HH)生殖腺取样位置示意图；

图2A是刚分离的PGCs形态培养图；

图2B是长期培养后聚团生长的PGCs形态培养图；

图3 AKP染色结果；

图4A是SSEA-1鉴定结果图(暗场)；

图4B是SSEA-1鉴定结果图(明场)；

图5 PGCs特异基因的RT-PCR鉴定图。

具体实施方式

一种新的分离鸡胚生殖嵴来源的原始生殖干细胞方法，包括以下步骤：

(1)早期胚胎(21-24HH)的收集和清洗