[发明专利]一种检测单碱基突变的方法

说明书

本发明涉及基因突变检测领域的一种检测单碱基突变的方法。该方法其包括以下步骤：S1，根据目标基因设计荧光信号探针；所述荧光信号探针与目标基因的突变型基因完全互补，与目标基因的野生型基因形成单碱基错配；S2，在含荧光信号探针的溶液中加入目标基因的待测样本和λ核酸外切酶，形成反应体系；S3，获取反应体系在反应过程中的实时荧光曲线，判断目标基因的待测样本中是否存在单碱基突变。本发明所述方法可以快速准确地对单碱基突变基因序列进行检测，且对单碱基突变基因序列具有高度的选择性，可用于低丰度突变检测。另外，所述方法的检测成本低廉、易于制备，操作简便，重复性高，易于推广到非专业人员操作。

技术领域

本发明属于基因突变检测技术领域，具体涉及一种检测单碱基突变的方法。

背景技术

基因测序技术表明，人类基因组中碱基的变化与肿瘤的形成发展有着密切的关系。在分离的大量肿瘤患者组织切片样品中，发现许多肿瘤细胞的基因组中存在单碱基点突变。但是在肿瘤发病早期，肿瘤细胞的含量低，突变基因在肿瘤细胞中的百分比也相对较低。

基因突变检测技术可以分为测序型和非测序型。测序型技术准确度高，能做重复序列但是样品制备成本高，需要的核酸浓度较高且分析时间长，不能做低丰度检测，难以在临床样品中直接检出低频突变。非测序型技术主要以核酸杂交探针为基础，其分析目标为已知突变基因的确认和含量测定。在动态DNA纳米技术的研究领域，一种新型的核酸杂交模式-核酸非稳态杂交近来受到关注。这种杂交模式是指双链核酸在其解链温度附近呈现杂交与解链的平衡。在这种平衡状态下，它可以突破核酸稳定杂交的热力学瓶颈，对单碱基变化非常敏感。在室温条件下，一般杂交的双链长度为9-12个碱基。在这种情况下，完全匹配的核酸双链与单碱基错配的核酸双链存在较大的杂交动力学差异，单碱基错配双链的解链动力学常数比完全匹配双链的高20-100倍。

λ核酸外切酶能作用于5’磷酸标记的双链DNA，沿5’到3’方向渐进性催化去除5’单核苷酸，其最适底物是5’磷酸化的双链DNA。λ核酸外切酶降解双链的速度对碱基配对情况敏感，错配的存在通常导致λ核酸外切酶的降解速度下降。

因此，结合核酸非稳态杂交和λ核酸外切酶，开发出能够检测低丰度单碱基突变的动力学方法，对于临床诊断研究和基础研究都有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种检测单碱基突变的方法，该方法可以快速准确地对单碱基突变基因序列进行检测，对突变序列具有高度的选择性，并且能用于低丰度突变的检测。

为此，本发明提供了一种检测单碱基突变的方法，其包括以下步骤：

S1，根据目标基因设计荧光信号探针；所述荧光信号探针与目标基因的突变型基因完全互补，与目标基因的野生型基因形成单碱基错配；

S2，在含荧光信号探针的溶液中加入目标基因的待测样本和λ核酸外切酶，形成反应体系；

S3，获取反应体系在反应过程中的实时荧光曲线，判断目标基因的待测样本中是否存在单碱基突变。

根据本发明，若获取的实时荧光曲线随时间变化呈上升趋势或随时间变化先呈上升趋势然后趋于平稳，则目标基因的待检样本中存在单碱基突变；若获取的实时荧光曲线随时间变化一直趋于平稳，则目标基因的待检样本中不存在单碱基突变。

根据本发明，所述荧光信号探针上带有荧光基团、荧光淬灭基团和5’端磷酸标记。

在本发明的一些实施方式中，所述荧光信号探针与目标基因互补的碱基个数为9-12个；优选地，所述荧光信号探针与目标基因互补的碱基个数为11-12个。

在本发明的另一些实施方式中，所述荧光信号探针与目标基因的野生型基因形成的单碱基错配位置位于目标基因的野生型基因5’端的第4-11位点，优选为第4-7位点，进一步优选为第4位点。