[发明专利]一种海马原代细胞培养体系的建立方法

说明书

本发明公开了一种海马原代细胞培养体系的建立方法。包括以下步骤：将活体海马进行表面消毒，于无菌条件下取出胚胎或肝脏，胚胎或肝脏经漂洗培养液漂洗后用胰蛋白酶消化，过滤除杂，离心，去掉上清液，细胞沉淀用原代生长培养液重悬，制得单细胞悬液，将单细胞悬液移入添加有原代生长培养液的培养瓶中培养，每2‑3天按半量换液方式更换原代生长培养液。本发明建立了一种稳定的海马原代细胞培养体系，为海马种质资源保存、细胞生物学、免疫学等领域的研究奠定了基础。本发明建立的线纹海马原代细胞培养体系操作简单，重复性强，细胞生长稳定，也可适用于其它海龙科鱼类细胞原代培养体系的构建。

技术领域：

本发明属于生物细胞培养技术领域，具体涉及一种海马原代细胞培养体系的建立方法。

背景技术：

原代培养是指由体内取出细胞、组织和器官后进行的首次培养，也叫初代培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。细胞系作为一种体外表达系统，专一性好，可重复性高，是一种有用的实验材料。鱼类细胞系在毒理学、免疫学、生理学、细胞遗传学、细胞生物学等学科上均有广泛的应用。

线纹海马(Hippocampus erectus)是海龙科(Syngnathidae)海马属(Hippocampus)的一种小型海洋硬骨鱼类，具有较高的观赏价值、药用价值与科研价值。由于旺盛的市场需求导致野生海马资源遭受过度捕捞，加上环境污染与生境破坏等影响，世界范围内的海马野生资源都已遭到严重破坏，部分海马种类已经濒临灭绝。目前对海马的研究多集中在海马行为学、生理学、养殖学、遗传学等方面，尚未见任何有关海马细胞培养的报道。本研究建立了一种稳定的海马原代细胞培养体系，为海马相关研究奠定基础。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种简单易行的海马原代细胞培养体系的建立方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种海马原代细胞培养体系的建立方法，包括以下步骤：将活体海马进行表面消毒，于无菌条件下取出胚胎或肝脏，胚胎或肝脏经漂洗培养液漂洗后用胰蛋白酶消化，过滤除杂，离心，去掉上清液，细胞沉淀用原代生长培养液重悬，制得单细胞悬液(细胞浓度约2×10⁴-2×10⁵细胞/mL)，将单细胞悬液移入添加有原代生长培养液的培养瓶中培养，每2-3天按半量换液方式更换原代生长培养液；所述的漂洗培养液为：以DMEM/F12培养基为基础培养基，所述的基础培养基中还添加有青霉素和链霉素；所述的原代生长培养液为：以DMEM/F12培养基为基础培养基，添加体积分数20％FBS、青霉素、链霉素、1-5ng/mL FGF和2-10ng/mL EGF。

所述的胚胎或肝脏经漂洗培养液漂洗后用胰蛋白酶消化，其消化时间优化为10-20min。

所述的将活体海马进行表面消毒具体为：用无菌海水浸泡活体海马20min，用无菌纱布吸干海马表面液体，再将海马置于体积分数75％酒精中浸泡1-2min，无菌海水漂洗海马2-3次。

所述的原代生长培养液优选为：以含体积分数20％FBS的DMEM/F12培养基为基础培养基，所述的基础培养基中还添加有400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素、5ng/mL FGF和2ng/mL EGF。

所述的海马优选为线纹海马(Hippocampus erectus)。