[发明专利]同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的核酸、试剂盒及方法

权利要求书

1.一组用于多重PCR同时检测三种病原的核酸，其特征在于，包括用于检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的上、下游引物，其中，所述腐烂病菌的上游引物序列如SEQ IDNo.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；

所述黄化病植原体的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示；

所述丛簇病菌的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示。

2.一组用于荧光定量PCR同时检测三种病原的核酸，其特征在于，包括如权利要求1中所述的用于检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的上、下游引物及各病原体对应的探针，

所述腐烂病菌的探针序列如SEQ ID No.3所示；

所述黄化病植原体的探针序列如SEQ ID No.6所示；

所述丛簇病菌的探针序列如SEQ ID No.9所示。

3.如权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，该组核酸还包括检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的阳性扩增产物，其中，

所述检测腐烂病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.10中第21-197bp所示的序列；

所述检测黄化病植原体的阳性扩增产物如SEQ ID No.11中第17-106bp所示的序列；

所述检测丛簇病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.12中第20-219bp所示的序列。

4.一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：如权利要求2中所述的用于检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的三种病原的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5'端和3'端分别标记TEXRED-BHQ2、FAM-TAMRA和CY5-BHQ3。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的三种病原的阳性扩增产物，其中，

所述检测腐烂病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.10中第21-197bp所示的序列；

所述检测黄化病植原体的阳性扩增产物如SEQ ID No.11中第17-106bp所示的序列；

所述检测丛簇病菌的阳性扩增产物如SEQ ID No.12中第20-219bp所示的序列。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括Premix EX Taq×2。

7.一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原的检测方法，其特征在于，该方法用于检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的三种病原，具体包括以下步骤：

(1)从样品中提取DNA；

(2)对提取的所述DNA进行荧光定量PCR扩增；其中，荧光定量PCR扩增时，在反应体系中，采用所述腐烂病菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，其探针5'端和3'端分别对应标记TEXRED和BHQ2；所述黄化病植原体的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，其探针5'端和3'端分别对应标记FAM和TAMRA；所述丛簇病菌的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示，其探针5'端和3'端分别对应标记CY5和BHQ3；

(3)收集荧光信号，选择步骤(2)中的荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。