[发明专利]同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的核酸、试剂盒及方法

说明书

本发明涉及一组用于同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的三种病原的核酸、试剂盒和检测方法，其中，用于多重PCR同时检测三种病原的核酸包括腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的上、下游引物；用于荧光定量PCR同时检测三种病原的核酸还包括有各病原对应的探针。本发明还建立了一种比较高效、灵敏的，可同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌这三种病原的检测方法。该方法能有效提高检测的灵敏度，避免假阴性结果的发生，为能有效预防黄化病、溃疡病和叶斑病提供一种技术手段。

技术领域

本发明属于生物检测技术，具体涉及一种用于同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的核酸、试剂盒及方法。

背景技术

腐烂病亦称腐朽病(decay)，又称烂皮病、臭皮病等，是果木极易产生的一种常见病，世界各地均有发生。腐烂病主要危害结果树的枝干，发病前期难以察觉，所以需要做好防治措施。发病初期从外表不易识别，如果掀开枝干的表皮，可见到暗褐色致红褐色湿润的小斑或黄褐色的干斑，有时，内部病变面积已较大了，而从外部仍不好识别。受害较重时皮层腐烂坏死，用手指按下即下陷。病皮极易剥离，烂皮层红褐色，湿腐状时有酒糟味。发病后期，病部失水干缩，变黑褐色下陷，并在上产生黑褐色小点粒，即病菌的分生孢子器，成为再发病的传染源。除侵染枝干外，有时也侵染果实。果实上病斑症状为暗红色的圆形或不规则形，有轮纹，边缘清晰。发病部位腐烂软化，略带酒糟味，病果表皮易剥离。

丛簇病期叶片生长缓慢，有时只能长到正常的叶片的1/3大，叶片皱缩并散布有褪绿斑，随着植株生长，顶端叶片呈现丛簇状，并向下卷曲，有的叶片逐渐黄化，呈浅绿色或浅黄色，产生条斑或斑驳状。茎节间缩短，呈簇生状。

黄化病是黄化植原体引起的病害，由过去的零星发病逐渐蔓延开来，感病初期被害叶轻度失绿变黄，但叶脉保持正常绿色，且一般由个别叶片失绿变黄，逐步蔓延到整个树冠，感病后期叶片变薄，枯萎缩小，枝条干枯，受害树逐渐枯死，造成了巨大的经济损失。植原体的检测方法有组织化学技术检测法和血清学方法，组织化学技术检测法是充分利用光学显微镜检查植物和介体昆虫体内植原体存在的有效手段，不是对植原体特异染色，只是对植原体的间接检测，容易造成假阳性。该方法与电子显微镜观察一样，在检测中都是结合症状特征，寄主范围以及抗生素实验进行的，费时费力，灵敏度低，而且只能证明待检植株是否感染植原体，无法区分不同的植原体，这些缺点限制了该类方法的应用，已经越来越不能满足现代生产的需要。

血清学方法是利用抗原抗体反应对植原体进行检测，已建立的诊断技术有琼脂双扩散、酶联免疫吸附法(ELISA)、斑点酶联免疫法 (Dot-ELISA)、免疫荧光染色及免疫电镜技术等。虽然血清学分析技术比电镜检测技术更具特异性和灵敏性，但多数多克隆抗体却与健康植物寄主抗原存在强烈的交叉反应，导致检测结果不准确。

苹果是世界上最重要的商品水果之一，我国是苹果的主产国，苹果产业在我国农村社会与经济中具有重要的地位和作用。近年来，苹果黄化病、腐烂病和丛簇病在我国苹果产区的发病率不断上升，三者复合侵染的情况越来越多，每年给我国苹果产业造成逾百亿元的经济损失。目前尚缺乏苹果黄化病、腐烂病和丛簇病的高效杀菌剂和抗病品种，一旦发现有感染这四种病害，需要及时清除病树，防止病害蔓延此外，还要加强非疫区的管理，防止这几种病害的侵入，因此，针对导致苹果腐烂病、黄化病和丛簇病的病原菌进行检测，建立早期快速同时检测的方法就显得尤为重要。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于多重PCR同时检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的核酸，还提供了采用多重实时荧光定量PCR检测腐烂病菌、黄化病植原体和丛簇病菌的核酸、试剂盒及其检测方法。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：