[发明专利]微生物发酵生产谷内酯的方法、工程菌及应用

说明书

本发明提供了通过微生物发酵生产谷内酯的方法、谷内酯生产工程菌及应用。所述通过微生物发酵生产谷内酯的方法包括利用谷内酯生产菌由甾醇发酵生产谷内酯，其特征在于，所述谷内酯生产菌具有至少一种脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶，该酶能够催化以下化合物I至II的反应i，并且所述方法包括抑制所述谷内酯生产菌中的至少一种所述脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶的活性和/或表达量，所述反应为：其中，“—X”为羟基或羰基；“—Y”为羟基或“—SCoA”。本发明可提高谷内酯发酵生产时的底物转化率，减少或阻断副产物的生成，使产物易于分离纯化，降低生产成本。

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体而言，涉及微生物发酵生产谷内酯的方法、工程菌及应用。

背景技术

甾体(也称为甾醇)是一类具有环戊烷多氢菲环结构的化合物，通常在C-10和C-13位有甲基基团，在C-17位有烷基侧链，其结构式如下式III所示。甾体作为一种细胞膜的组分，在生物体中具有重要的作用。一些甾体还具有激素和信号分子的作用。自上世纪50年代发现甾体药物以来，到目前为止已经鉴定了300多种甾体药物。甾体药物具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。近年来，甾体药物在医疗领域的应用范围不断扩大，被广泛用于治疗风湿病、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等，甾体激素药物已成为仅次于抗生素的第二大类药物。

根据《甾体化学进展》(周维善、庄治平主编，科学出版社2002年出版，ISBN 7-03-009607-X)报道，很多微生物包括诺卡氏菌(Nocardia)、分枝杆菌(Mycobacterium)、节杆菌(Arthrobocter)、和假单胞杆菌(Pseudomonas)等都可将甾体母核环戊烷多氢菲及侧链全部氧化成二氧化碳和水。甾体的代谢途径经Sih及其合作工作者(参考文献“Sih CJ,TaiHH,Tsong YY,Lee SS,Coombe RG.Mechanisms of steroid oxidation bymicroorganisms.XIV.Pathway of cholesterol side-chaindegradation.Biochemistry.1968；7:808-18.”、“Sih CJ,Tai HH,Tsong YY.Themechanism of microbial conversion of cholesterol into 17-keto steroids.J AmChem Soc.1967；89:1957-8.”和“Sih CJ,Wang KC,Tai HH.Mechanisms of steroidoxidation by microorganisms.XIII.C22acid intermediates in the degradation ofthe cholesterol side chain.Biochemistry.1968；7:796-807.”)的研究阐述如图1所示。该过程表明，在微生物降解过程中可通过控制不同酶的活力，获得如4AD(化合物15)、ADD(化合物16)、9-OH-AD和谷内酯(化合物24)等重要的中间体。又据微生物研究中广泛使用的《伯杰氏系统细菌学手册》(Bergey’s manual of systematic bacteriology)，红球菌(Rhodococcus)与分枝杆菌和诺卡氏菌具有许多相同的特征，曾被分类为分枝杆菌属。2012年，在红球菌中发现了与分枝杆菌类似的甾醇降解基因簇(参见文献“Mohn WW,WilbrinkMH,Casabon I,Stewart GR,Liu J,van der Geize R,et al.Gene cluster encodingcholate catabolism in Rhodococcus spp.J Bacteriol.2012；194:6712-9”)，因此可以认为，红球菌具有与图1描述的一致的甾醇代谢途径。